暴芳芳 孙勇虎 孙乐乐 周桂芝 刘永霞 刘 红 张福仁

1 临床资料

患者，女，47岁。双侧眼周散在丘疹2个月，无自觉症状。患者发病前半月曾在当地美容院因除皱注射肉毒杆菌毒素。发病初期眼周出现豆粒大丘疹，后逐渐增大。体格检查：系统查体未见明显异常。皮肤科查体：右侧眼周两个孤立黄豆大皮色丘疹，触之较韧(图1a)。左侧眼周3个孤立丘疹，其中1个呈暗红色，触之较软(图1b)。所有皮疹均无压痛。实验室检查：血常规、肝肾功能未见明显异常。皮损病理检查示：表皮大致正常，真皮中深层中性粒细胞、组织细胞、淋巴细胞、巨细胞浸润。PAS染色未见菌丝孢子。抗酸染色抗酸菌阴性。组织病理呈感染性肉芽肿改变(图2)。组织块血琼脂平板(BA)培养7天可见菌落生长，抗酸染色示阳性杆菌(图3)。行病理检查同时对组织块进行分子鉴定，与生长菌落测序结果一致，符合龟分枝杆菌序列(图4、5)。诊断：龟分枝杆菌感染。药物敏感性试验结果示该菌对克拉霉素、阿米卡星敏感。治疗：给予阿米卡星0.2 g，肌注，每日2次，克拉霉素500 mg，口服，每日1次，1个月后改为克拉霉素500 mg，口服，每日两次，共治疗3个月后皮损痊愈(图1c,d)。

图1 a、b：患者治疗前左右两侧眼周呈皮色及暗红色的豆大丘疹、结节；c、d：治疗后皮损痊愈，留有部分色素沉着

2 培养及分子鉴定

将新鲜组织块剪碎分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)28℃和血琼脂平板(BA)35℃进行真菌及细菌培养。 SDA和BA培养7天均可见光滑、湿润奶油色菌落生长，取菌落涂片行抗酸染色示阳性杆菌，初步判断为分枝杆菌，将菌落转种于改良罗-琼培养基(中性)，3天后可见明显菌落生长，呈淡黄色、粗糙、菜花样。将菌落提取DNA，应用细菌(16sRNA全长)、分枝杆菌(16sRNA、Hsp65、rpoB、16S-23SrDNA区域)通用引物进行PCR及测序，将测序结果在美国国立生物技术信息中心数据库NCBI 中进行比对，结果与龟分枝杆菌符合。

3 药敏试验

应用K-B纸片琼脂扩散法对分离菌株进行体外药物敏感性试验。药物种类包括多西环素、克拉霉素、阿米卡星、环丙沙星中介，亚胺培南、复方新诺明、左氧氟沙星和利福平。培养基为哥伦比亚血琼脂培养基，配置菌悬液浓度为0.5麦氏单位浊度，均匀涂布于血平板，将药物纸片置于平板中心，置于35℃温箱，72小时观察结果。根据不同抗生素抑菌直径的大小确定敏感、中介和耐药，结果示该菌对克拉霉素、阿米卡星敏感，环丙沙星中介，亚胺培南、复方新诺明、多西环素、左氧氟沙星和利福平耐药。

图2 表皮大致正常，真皮中深层中性粒细胞、组织细胞、淋巴细胞、巨细胞浸润(HE,a:×100;b:×400)图3 a:血琼脂平板(BA)细菌培养7天可见光滑、湿润奶油色菌落生长；b：抗酸染色示阳性杆菌(×1000)

图4 菌落提取DNA进行Sanger测序峰图

4 讨论

非典型分枝杆菌(Non tuberculous Mycobacterium,NTM)是除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌之外的其他分枝杆菌，包括偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌等[1]。龟分枝杆菌由Freidmann于1903年从龟甲中分离出，此菌是一种环境腐生菌，可广泛存在于土壤、灰尘、供水系统等，人类感染大多系医疗器械消毒不严。上世纪七十年代起国外出现龟分枝杆菌感染病例报道，多为经手术或注射等创伤感染，包括肺部、皮肤、皮下组织等[2，3]。国内最早关于龟分枝杆菌感染的病例为1985年梅建等报道的肺部感染一例[4，5]，此后陆续有临床感染病例报道，如张忠奎等[6]报道外伤导致的下肢皮肤结节、溃疡最终鉴定为龟分枝杆菌感染，柳青等[7]报道一例患者血液中分离出龟分枝杆菌。近年来由于美容行业的发展，注射美容、填充吸脂术等广泛应用，随之而来的感染病例也逐年增多，多见于整形外科报道。国外见纹身、皮下注射填充物后龟分枝杆菌感染的报道[8，9]。国内学者陈帅[10]、岳江涛[11]等曾报道面部溶脂针注射后非典型分枝杆菌感染的病例，但均未将致病菌鉴定到种[10，11]。金彦等[12]曾报道2例分别由面部注射术后引起的感染，菌种鉴定为脓肿分枝杆菌。面部注射肉毒素致龟分枝杆菌感染国内鲜有报道。

图5 测序结果在NCBI 数据库中进行比对，结果与龟分枝杆菌符合率100%

此菌感染的临床表现多样，通常在接种1～2个月出现，早期表现为无自觉症状的红斑、丘疹、皮下结节，随着时间迁移会出现波动及溃疡或形成窦道，有时皮损形态、分布与孢子丝菌病类似从而易导致误诊，免疫抑制患者甚至可出现全身播散性感染。因此在对常规治疗抵抗或呈现“冷”脓肿的患者应仔细追问病史如有无外伤史、注射史等并考虑此类菌的感染。治疗可根据培养菌株的药敏实验结果进行相应系统用药并可配合局部手术切除，目前几乎所有龟分枝杆菌对克拉霉素敏感，治疗时间需3～6个月或更长时间[13]。

由于此类感染在临床相对少见，因此临床医生对此类感染警觉性不高，加上对实验室检查重视不够易导致误诊。随着分子生物学技术的发展，应用病原微生物基因组某区域的特异性DNA片段，通过PCR及测序技术能快速、准确将病原菌鉴定至种水平，可作为临床辅助检查的重要手段。由于皮肤感染的临床表现多样，凭肉眼观察往往无法判定感染病原菌类型，因此对感染性皮损进行真菌(ITS区域)、细菌(16sRNA全长)、分枝杆菌(16sRNA、Hsp65、rpoB、16S-23SrDNA区域)等多种微生物检测有利于快速、准确、全面寻找病因，避免误诊漏诊。