黄平，窦长武，鞠海涛，王宏伟，肖瑞，牛丽丽

0 引言

脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，原发于神经上皮细胞，约占颅内肿瘤的40%～50%[1]，脑胶质瘤具有广泛的侵袭性，其恶性程度高，发病机制尚不清楚，手术难以彻底切除，且生长速度快，术后易复发，预后差。

信号转导与转录激活因子（signal transducers and activators of transcription, STAT）是一种信号转导和转录活化因子蛋白，激活后可以转入细胞核内与特异性DNA结合[2]，从多个方面调节细胞的生长、存活、分化和凋亡。STAT1是该家族的重要成员之一，在肿瘤形成过程中包括细胞周期进展、细胞凋亡、肿瘤血管生成以及肿瘤免疫监视中发挥重要的作用，但该基因与胶质瘤发生、发展的关系，以及如何调控并作用于神经上皮组织，目前国内外尚无系统的报道。本研究探讨STAT1与相关蛋白P53、P21、bcl-2、Caspase-8的相关性和变化趋势，进一步探讨STAT1对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响及可能的机制，为胶质瘤治疗的新策略提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人脑胶质瘤U251细胞由内蒙古医科大学分子病理学实验室提供，在含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中培养，培养条件为5%CO2、37℃，实验时取对数生长期细胞。

1.2 主要试剂与仪器

pcDNA3.1-STAT1质粒（内蒙古医科大学附属医院神经外科鞠海涛博士惠赠），DMEM/F-12(1:1)细胞培养液、胎牛血清、0.25% 胰酶（美国Gibco公司），LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），STAT1 p84/p91多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），P53、P21抗体（美国Santa Cruz公司），bcl-2、Caspase-8抗体（Abcam公司），人抗鼠IgG（H+L）（美国LI-COR公司）；荧光显微镜（中国Nikon公司），Western blot红外荧光扫描系统（奥德赛CLX），Thermo酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 细胞转染

按LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒说明，制备LipofectamineTM2000复合物：每孔240 μl无血清无双抗培养基+10 μl LipofectamineTM2000（总体积250 μl），室温孵育5 min；DNA复合物：每孔246 μl 无血清无双抗培养基+4 μg质粒（质粒浓度为1.0 μg/μl），总体积250 μl；将两个复合物混合制成DNA-LipofectamineTM2000复合物，室温静置20 min；将6孔板中的细胞用无血清无双抗的培养基清洗细胞2次，加入2 ml无血清培养基；将复合物逐滴加入孔中，轻轻摇动6孔板，使其混匀，37℃、5%CO2的培养箱中保温6 h后，更换含血清无双抗的培养基，37℃、5%CO2的培养箱培养48 h后进行下一步检测。将细胞分为Mock组（无转染）、空载组（转染pcDNA3.1）和STAT1组（转染pcDNA3.1-STAT1）。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性

转染前一天，细胞换液，胰酶消化，计数，以1×105个/孔接种于96孔板中，每孔加入含血清无双抗的DMEM 200 μl，设置调零组和对照组，每组10个复孔，37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h；每孔加入1 μg/μl质粒0.2 μl，LipofectamineTM2000转染试剂0.5 μl；分别在转染24、48 h后向每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，继续培养；4 h后终止培养，去除培养液，每孔加入DMSO 150 μl，低速振荡10 min，充分溶解MTT试剂；酶联免疫仪上选择490 nm波长测定吸光度值，并计算10个复孔的平均值。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

取对数期细胞，倒去培养液，0.25%胰酶消化细胞，用完全培养液轻轻吹打，1 000 r/min，离心5 min去上清液；加入4 ml PBS重悬细胞，吹打均匀后，再次1 000 r/min，离心5 min去上清液；加入1.2 ml PBS重悬细胞后，再加入2.8 ml 70%（预冷）乙醇中，轻轻吹打均匀，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。1 000 r/min，5 min收集固定细胞，加入4 ml PBS重悬细胞，轻轻吹打均匀后，再次1 000 r/min，离心5 min去上清液；用0.4 ml PBS重悬细胞，轻轻吹打（防止细胞破碎）；加RNase-A约3 μl至终浓度约为50 μg/ml，37℃水浴消化30 min；加PI约50 μl（此时终浓度为65 μg/ml），避光染色30 min。尼龙网过滤，上机检测。

1.6 划痕实验检测细胞迁移

在6孔板背后划横线做标记，线与线间隔约1 cm，在每孔中加入约5×105个细胞；细胞贴壁后，枪头划痕，PBS清洗细胞3次，加入无血清无双抗培养基；然后进行质粒转染4～6 h后更换无血清无双抗培养基，并放入细胞培养箱培养，分别在0和24 h后取出拍照。

1.7 Western blot法检测转染后各组U251细胞中细胞周期相关蛋白P53、P21的表达情况

按照蛋白提取试剂盒说明，提取转染48 h后细胞的总蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后，100℃煮沸制备蛋白样品。配置10%的分离胶，5%浓缩胶，胶凝固后进行上样，上样时应保证每孔蛋白量一致，浓缩胶电泳时间30～40 min，电压为90 V，分离胶电泳时间为60～90 min，电压为160 V，电泳至溴酚蓝到达玻璃板下缘时终止电泳，进行转膜，将膜放入平皿中（蛋白面朝上），倒入之前配好的封闭液，室温下脱色，摇床上摇动封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜2次，10分钟/次，加入荧光二抗常温孵育1 h，TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min。将PVDF膜进行扫描，拍照并记录。

1.8 统计学方法

应用SPSS17.0软件对数据进行分析。计量资料以（±s）表示，对数据采用单因素方差分析进行统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-STAT1质粒转染U251细胞

倒置相差显微镜下可见，Mock组转染48 h后细胞生长状态良好、形态均匀、细胞增殖旺盛且折光性好；与Mock组相比，空载组有少量细胞碎片及死细胞漂浮，但细胞生长状态无明显差异；与Mock及空载组相比，STAT1组培养液中可见较多死细胞漂浮及细胞碎片，贴壁细胞数量明显减少，且生长缓慢，形态不规则，伸长或皱缩，折光性较差，见图1。荧光显微镜下观察转染效率，STAT1组可见较多绿色荧光蛋白表达，见图2。

2.2 Western blot检测pcDNA3.1-STAT1质粒转染后STAT1蛋白表达情况

空载和pcDNA3.1-STAT1分别转染脑胶质瘤U251细胞48 h后，Western blot法检测各组STAT1蛋白表达，结果显示，与Mock组、空载组相比较，STAT1组的STAT1蛋白表达量明显增高（1.26±0.25），差异有统计学意义 (P=0.043），而Mock组和空载组间差异无统计学意义，见表1、图3。

2.3 MTT比色法检测pcDNA3.1-STAT1转染U251细胞后细胞增殖活性

将转染的脑胶质瘤U251细胞培养48 h后，用MTT法检测各组的细胞增殖活性，以检测高表达的STAT1对U251细胞增殖活性的影响。结果显示，三组差别有统计学意义（P=0.000），见表2。说明转染STAT1后明显的抑制脑胶质瘤U251细胞的增殖。

表1 转染pcDNA3.1-STAT1后胶质瘤U251细胞STAT1蛋白的表达Table1 Expression of STAT1 protein in glioma U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1

表2 各组各时间点脑胶质瘤U251细胞增殖活性测定 (±s)Table2 Proliferation activity of glioma U251 cells at different time points in each group (±s)

表2 各组各时间点脑胶质瘤U251细胞增殖活性测定 (±s)Table2 Proliferation activity of glioma U251 cells at different time points in each group (±s)

Notes: *: P＜0.05, compared with Mock group; #: P＜0.05, compared with Mock group and Empty vector group, respectively

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2.4 流式细胞仪检测转染pcDNA3.1-STAT1后对U251细胞周期的影响

PI染色检测STAT1转染U251细胞48 h后时的细胞周期情况，结果显示：与Mock及空载组相比，STAT1组G0/G1期细胞比例明显升高，S期比例明显下降，差异均具有统计学意义（P=0.006;P=0.033）。结果显示，STAT1可抑制脑胶质瘤U251细胞的DNA合成及有丝分裂，导致细胞阻滞在G0/G1期，见表3、图4。

2.5 细胞划痕实验检测转染pcDNA3.1-STAT1后对胶质瘤U251细胞迁移能力的影响

图1 转染48 h后倒置相差显微镜下观察各组细胞的生长情况 (×200)Figure1 Growth of glioma U251 cells observed under inverted phase contrast microscope 48 h after transfection (×200)

图2 转染48 h后荧光显微镜观察pcDNA3.1-STAT1转染情况 (×200)Figure2 Glioma U251 cells observed under fluorescence microscopy 48h after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (×200)

表3 转染48h后STAT1对脑胶质瘤U251细胞周期的影响Table3 Effect of STAT1 on cell cycle of glioma U251 cells 48h after transfection

结果显示，24 h后Mock组细胞就已经迁移越过划痕范围，空载组迁移能力较Mock组细胞略差，而STAT1组进入空白处的细胞明显减少，细胞迁移能力受到抑制，见表4、图5。结果表明STAT1的高表达抑制了脑胶质瘤细胞的迁移能力（P=0.001）。

2.6 Western blot法检测转染pcDNA3.1-STAT1后各组U251细胞中P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表达情况

空载质粒和pcDNA3.1-STAT1分别转染脑胶质瘤U251细胞48 h后，Western blot检测各组蛋白表达。STAT1组与Mock和空载组相比，P53、P21、Caspase-8表达明显增强，bcl-2表达明显减弱，STAT1组与Mock组和空载组相比均有显著差异（均P＜0.05）；而上述蛋白表达在空载组和Mock组差异无统计学意义（P＞0.05），见表5、图6～7。

图3 转染pcDNA3.1-STAT1 48h后STAT1在U251细胞中的表达Figure3 Expression of STAT1 in U251 cells 48h after transfection with pcDNA3.1-STAT1

表4 细胞划痕实验检测转染pcDNA3.1-STAT1 24h后对胶质瘤U251细胞迁移能力的影响Table4 Migration ability of U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 for 24h detected by wound healing assay

图4 转染48h后STAT1对脑胶质瘤U251细胞周期的影响Figure4 Effect of STAT1 on cell cycle of glioma U251 cells 48h after transfection

3 讨论

胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最具有破坏性与侵略性的肿瘤[3]，约占胶质瘤的50%左右[4]。近年来脑胶质瘤的发病率呈年轻化趋势，以青壮年为主要发病人群[5]。据统计，脑胶质瘤患者手术后中位生存时间平均约12～18月，5年生存率＜10%[6]。近年来，随着分子诊断概念的引入和精准医学的推广[7]，胶质瘤患者术后的生存率较前有所提高，但平均生存期仍然低于15月。随着相关调控基因的发现与认识，基因治疗开始进入包括胶质瘤在内的各种恶性肿瘤的研究领域，并且被认为是目前除手术、放疗和化疗以外的“第四模式”。

STAT是一种信号转导和转录活化因子蛋白，是细胞因子/生长因子信号转导中重要的胞质转录因子，激活后可以转入细胞核内与特异性的DNA结合，从多个方面调节细胞的生长、存活、分化和凋亡。STAT1是该家族的重要成员之一，它不仅可被细胞因子激活，也可被生长因子激活，比如表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF-1）[8]。目前已知STAT1在多种肿瘤细胞中表达，如白血病[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]等。STAT1在肿瘤形成过程中包括细胞周期进展、细胞凋亡、肿瘤血管生成以及肿瘤免疫监视中发挥重要的作用，并且已有相关研究证实STAT1基因在肿瘤细胞的生长、分化、转移、侵袭等方面发挥了关键的调节作用[12]，同时国内学者已证实STAT1在脑胶质瘤缺氧时起肿瘤抑制作用[13]。但该基因与胶质瘤发生、发展的关系，以及如何调控并作用于神经上皮组织，目前国内外尚无系统的报道。

图5 细胞划痕实验检测转染pcDNA3.1-STAT1后对胶质瘤U251细胞迁移能力的影响Figure5 Migration ability of U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 detected by wound healing assay

表5 P53、P21、bcl-2、Caspase-8在转染pcDNA3.1-STAT1脑胶质瘤U251细胞中的表达 (±s)Table5 Expression of P53, P21, bcl-2 and Caspase-8 in U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (±s)

表5 P53、P21、bcl-2、Caspase-8在转染pcDNA3.1-STAT1脑胶质瘤U251细胞中的表达 (±s)Table5 Expression of P53, P21, bcl-2 and Caspase-8 in U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (±s)

Note: *: P＜0.05, compared with Mock and Empty vector group,respectively

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图6 P53、P21在转染STAT1脑胶质瘤U251细胞中的表达Figure6 Expression of P53 and P21 in U251 cells after transfection with STAT1

图7 bcl-2、Caspase-8在转染STAT1脑胶质瘤U251细胞中的表达Figure7 Expression of bcl-2 and caspase-8 in U251 cells after transfection with STAT1

在前期实验中已证实，STAT1在胶质瘤组织中低表达，而在正常脑组织中高表达[14-15]。本研究中，Western blot结果显示在胶质瘤U251细胞系中STAT1蛋白为高表达；MTT结果显示，瞬时转染pcDNA3.1-STAT1质粒后，STAT1组U251细胞增殖明显受到抑制。由此可知，LipofectamineTM2000成功将pcDNA3.1-STAT1导入U251细胞中，并且转染后高表达的STAT1可抑制胶质瘤U251细胞的生长。此外，细胞周期阻滞是导致细胞凋亡重要的原因。本研究流式细胞技术结果显示，与Mock组和空载组相比，脑胶质瘤U251细胞系中高表达的STAT1可显著抑制细胞周期进程，使细胞周期停滞在G0/G1期，从而促进细胞凋亡发生；因此，高表达的STAT1能够诱导胶质瘤细胞产生G0/G1期阻滞，从而减弱胶质瘤细胞体外的增殖能力；划痕实验发现在STAT1转染24 h后，STAT1组迁移能力急剧下降。这一结果提示STAT1的高表达可直接抑制脑胶质瘤细胞的迁移能力。

P53是一种抑癌基因，在恶性肿瘤中，有超过50%的该基因发生突变。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，它控制着细胞周期的启动，当细胞缺乏P53基因时，即使在不利条件下，细胞仍可以继续进行分裂。与所有其他的肿瘤抑制基因相同，P53基因可减慢正常细胞的分裂[16]。P21是CIP家族的成员，是位于P53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，它可以通过对细胞周期的作用，抑制某些细胞的有丝分裂活动，从而抑制细胞生长。P21可以和P53共同构成细胞周期G1/S检查站，参与细胞周期的调节[17]。有学者以siRNA-STAT1和pcDNA3.1-STAT1转染肝癌HepG2细胞，通过Western blot法检测转染细胞中P53、Cyclin E的表达水平，发现STAT1可以上调P53的表达，抑制Cyclin E的表达，从而导致了细胞周期阻滞、生长抑制和细胞凋亡[18]。

细胞周期阻滞涉及复杂的分子级联反应，各种基因的功能障碍可能导致细胞周期阻滞的发生和发展。研究表明，STAT1抗肿瘤效应是通过上调P53实现的[19]，而P53的上调又可以促进P21的表达[20]，使细胞周期阻滞于G1/S期，而细胞凋亡常发生于细胞周期的G1期，从而导致细胞发生凋亡[21]。正常情况下细胞分裂周期进程的转化由Cyclin-CDK（Cyclin-dependent kinase）复合物对细胞精确而严密的调控，例如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2及其抑制剂（CKI）P21Cip1、P27Kip1的活性来动态调节细胞进程。研究表明，P53可诱导P21Waf1调控Cyclin E/CDK2和Cyclin A/CDK2复合物使RB磷酸化，P53和RB通路共同调控细胞周期G1/S转换，而肿瘤细胞中这两条通路往往同时失调[22]。

B细胞淋巴瘤-2（bcl-2）家族蛋白被认为是程序性细胞死亡和凋亡的关键调节因子，在人类癌症中具有突出作用[23]。根据其功能可分为两类蛋白亚群[24]：一类为凋亡抑制蛋白（bcl-2、bcl-xL、bcl-xY等），是抗癌治疗的主要靶点；另一类为凋亡促进蛋白（bax、bix、bad等）。所有bcl-2家族蛋白都具有共同的bcl-2同源（BH）结构域。bcl-2蛋白能调节内质网和线粒体中适宜的Ca2+浓度，使其保持动态平衡，避免线粒体中由于Ca2+浓度过高而引起细胞凋亡。此外，bcl-2还依靠抑制线粒体释放细胞色素C来抑制细胞的凋亡，同时还可以抑制Smac/DIABLO的释放[25]。Caspase-8是死亡受体介导的凋亡途径中关键的启动因子，细胞凋亡依赖一类对天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）产生的级联反应。Caspase-8能够通过寡聚而自身切割活化，并能激活下游半胱氨酸蛋白酶，产生凋亡效应[26]。

本实验中，我们通过Western blot检测了P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表达情况，结果表明，STAT1组的P53、P21、Caspase-8表达明显增加，bcl-2表达明显降低，其机制可能为STAT1可上调P53、P21、Caspase-8，下调bcl-2，使细胞周期阻滞于G0/G1期，而细胞凋亡常发生于细胞周期的G1期，从而导致细胞发生凋亡。这说明STAT1调控细胞增殖、凋亡作用是经多分子信号途径来实现的，这可能是脑胶质瘤发生的机制之一，但此推测还需要大量的实验进一步验证和研究。