古辉 徐小彭 黄国华 李雪平 陈少立

佛山市高明区人民医院呼吸内科（广东佛山528500）

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease ，COPD）是老年人中最常见的呼吸系统慢性疾病之一，也是导致全球老年人死亡的主要疾病之一［1］。越来越多的证据表明，嗜酸性粒细胞性COPD 是该疾病的一种独特表型，其特征是恶化风险较高但吸入糖皮质激素治疗反应较好［2］。与老年人相比，COPD 受试者痰中嗜酸性粒细胞百分比和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白浓度显著增高，并且在疾病恶化期间，其气道嗜酸性粒细胞数量进一步增加［3］。既往研究［4］数据显示，37.4%的COPD 患者表现出持续的血液嗜酸性粒细胞计数大于或等于2%。血液嗜酸性粒细胞计数增高的非过敏性COPD 患者其特征是气道嗜酸性粒细胞数量显著增加，痰中白细胞介素（IL）⁃5 和触珠蛋白水平升高，伴随着显著的气道重塑，其支气管肺泡灌洗液（BAL）中的趋化因子CCL20 和CCL24 浓度也显著增高，表明这种嗜酸性粒细胞在COPD 的炎症和气道重塑过程中发挥重要的作用［5］。

白细胞介素33（interleukin 33，IL⁃33）主要由上皮细胞产生，是应答细胞外各种病变而产生的警报性因子之一［6］。最近的研究［7］表明，IL⁃33 在IL⁃5 之前调节嗜酸性粒细胞的作用，是嗜酸性粒细胞维持稳态所必需的关键细胞因子。IL⁃33 可以激活并增强造血祖细胞（hemopoietic progenitor cells，HPC）的成熟。HPC 被认为是过敏性哮喘中的先天效应细胞［8］：它们产生大量的促炎细胞因子，并在炎症部位的“原位造血”过程中分化为成熟的嗜酸性粒细胞，但目前对于IL⁃33 其与COPD患者中气道嗜酸性粒细胞的关系仍未明确。呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中存在大量的介质因子，其能反应呼吸道中各种病理变化，并有望成为呼吸疾病新的生物标记物重要来源标本。本研究旨在探讨COPD 患者中呼出气冷凝液中IL⁃33 的表达水平，并探讨其与COPD 患者中嗜酸性粒细胞以及炎症程度之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年9月至2018年7月于我院就诊的COPD 患者共60 例，纳入标准：（1）符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》［9］的诊断标准；（2）年龄不限；（3）获得患者知情同意并签署知情同意书。排除标准：（1）合并机体免疫性疾病的患者；（2）合并恶性肿瘤；（3）合并支气管哮喘、扩张、肺结核的患者；（4）合并急性心肌梗死的患者；（5）近1 个月内采用免疫抑制剂或激素治疗的患者；（6）合并全身炎症反应及内分泌疾病的患者。选择同期年龄相近的健康体检者共50 例作为对照组，本研究获得医院伦理委员会审核并批准。

1.2 检测指标和方法 （1）呼出气冷凝液的收集和保存：所有参与者采用便携式呼出气冷凝液收集器收集呼出气冷凝液，在收集之前充分让患者了解操作流程。嘱托患者收集前先采用蒸馏水漱口，充分清理口腔中的食物残渣和分泌物；收集时让患者做平静呼吸，收集时间为20 min，在收集期间注意冷凝管温度的稳定性。将收集到的冷凝液存储于2 mL 的冷冻管，并在收集完30 min 后放-80 ℃冰箱进行保存以待检测。（2）血液样本的收集：所有参与者清晨空腹抽取静脉全血，置于真空抗凝管保存，经3 000 r/min 离心后，取血清保存于-80 ℃冰箱进行保存以待检测。（3）ELISA 检测：检测冷凝液中的IL⁃33 的表达水平，同时检测血清的IL⁃33、IL⁃6、IL⁃8、TNF⁃α的水平，所有试剂盒购自R&D SYSTEM，严格按照说明书的步骤规范操作。（4）气道嗜酸性粒细胞检测：所有COPD 患者健康受试者通过气道雾化收集痰液，经过消化并过滤后，将过滤液在离心后固定采用HE 染色，对标本在镜下进行观察计数，记录嗜酸性粒细胞的比例。

1.3 临床指标记录 记录所有COPD 患者和参与者的基本资料，包括年龄、性别、BMI、是否为稳定期或AECOPD；记录所有COPD 患者的肺功能检测指标，根据肺功能检测采用GOLD 分级系统对肺功能进行分级，记录所有患者的血常规中的嗜酸性粒细胞水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0 进行统计分析，计量资料采用均数± 标准差表示，比较采用t检验，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK 法检验；计数资料采用百分比表示，比较采用卡方检验，两指标的相关性评估采用Spearman 相关分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 两组患者的平均年龄、性别比例和平均BMI 比较差异没有统计学意义（P＞0.05），60 例COPD 患者其平均病程为（4.2 ± 1.8）年，其中处于COPD稳定期的39例，急性加重期的21 例，GOLD 分级Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为21、28、11 例（表1）。

表1 两组患者的一般情况比较Tab.1 Comparison of general conditions between the two groups of patients±s，例

表1 两组患者的一般情况比较Tab.1 Comparison of general conditions between the two groups of patients±s，例

临床项目年龄（岁）性别（男/女）BMI(kg/m2)病程（年）分期（稳定期/AECOPD）GOLD 分级(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ)COPD 组（n=60）67.2±5.7 34/26 23.1±1.9 4.2±1.8 39/21 21/28/11对照组（n=50）65.6±7.3 31/19 22.8±2.3- - -t/χ2值t=1.290 χ2=0.321 t=0.749- - -P 值0.200 0.571 0.455- - -

2.2 两组患者其IL⁃33 及相关临床指标对比 其中COPD 组的平均呼出气冷凝液IL⁃33 水平为（3.1±0.6）pg/mL，显著高于对照组的（1.4±0.5）pg/mL，差异具有统计学意义（t=15.943，P＜0.05）；且COPD 组的平均气道嗜酸性粒细胞比例、血嗜酸性粒细胞比例、血清IL⁃33、IL⁃6、IL⁃8 和TNF⁃α水平均显著高对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），其中COPD 组的平均FEV1/FVC 为（56.7 ± 6.8）%（表2）。

表2 两组患者的相关临床指标比较Tab.2 Comparison of relevant clinical indicators between the two groups of patients±s

表2 两组患者的相关临床指标比较Tab.2 Comparison of relevant clinical indicators between the two groups of patients±s

临床参数冷凝液IL-33（pg/mL）气道嗜酸性粒细胞（%）血嗜酸性粒细胞（%）血清IL-33（pg/mL）IL-6（pg/mL）IL-8（pg/mL）TNF-α（pg/mL）FEV1/FVC（%）COPD 组（n=60）3.1±0.6 3.4±0.7 4.3±1.9 35.2±7.4 193.1±41.5 52.5±21.1 74.7±24.5 56.7±6.8对照组（n=50）1.4±0.5 0.9±0.2 2.5±1.3 22.6±5.5 108.1±32.3 10.6±4.5 16.9±8.6-t 值15.943 24.420 5.680 9.961 11.804 13.773 15.877-P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001-

2.3 不同严重程度COPD 患者的呼出气冷凝液IL⁃33 水平对比 其中AECOPD 的COPD 患者呼出气冷凝液IL⁃33 水平显著高于稳定期的患者，差异具有统计学意义（t=17.268，P＜0.001），且不同GOLD 分级COPD 患者的呼出气冷凝液IL⁃33 水平对比差异具有统计学意义（F=5.127，P=0.004），其中GOLD 分级Ⅳ级的呼出气冷凝液IL⁃33 水平显著高于Ⅱ级和Ⅲ级，GOLD 分级Ⅲ级的显著高于Ⅱ级，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同分期和GOLD 分级COPD 患者的呼出冷凝液IL⁃33 水平比较Tab.3 Comparison of exhaled lysate IL⁃33 levels in COPD patients with different stages and GOLD grade ±s

表3 不同分期和GOLD 分级COPD 患者的呼出冷凝液IL⁃33 水平比较Tab.3 Comparison of exhaled lysate IL⁃33 levels in COPD patients with different stages and GOLD grade ±s

指标分期稳定期AECOPD GOLD 分级Ⅱ级Ⅲ级Ⅳ级例数39 21 21 28 11冷凝液IL⁃33（pg/mL）2.7±0.3 4.7±0.6 2.9±0.3 3.4±0.5 4.3±0.5 t/F 值17.268 5.127 P 值＜0.001 0.004

2.4 呼出气冷凝液IL⁃33 水平与嗜酸性粒细胞及炎症因子的相关性 60 例COPD 患者呼出气冷凝液IL⁃33 水平与血清IL⁃33、气道嗜酸性粒细胞比例、血嗜酸性粒细胞比例、IL⁃6、IL⁃8 和TNF⁃α呈显著的正相关（P＜0.05），呼出气冷凝液IL⁃33 水平与肺功能指标中的FEV1/FVC 呈显著的负相关（r＝⁃0.392，P＝0.002）（表4）。

表4 呼出气冷凝液IL⁃33 水平与各项指标的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of IL⁃33 level of exhaled condensate and various indicators（n=60）

3 讨论

呼出气冷凝液（EBC）有望成为肺部疾病新的生物标志物的重要来源。EBC 可以被认为是体液或呼出气体的冷凝物，能反映气道中呼吸道液体成分的变化［10］。研究表明，EBC 中可能包含过氧化氢、蛋白质、细胞因子，类二十烷酸，和大分子如粘蛋白，磷脂和DNA 等一系列成分和因子。在疾病状态中，EBC 含有反映该疾病的分子或更高浓度的特定标记物。例如，患有胃食管反流病的患者在其EBC 中已被证实患有胃蛋白酶。已经有研究证实COPD 和哮喘患者在支气管激发后在EBC中的活性氧水平和组胺水平显著升高。

IL⁃33 是IL⁃1 家族的新成员，由于其在免疫应答中的功能而引起了极大的关注。它主要在各种炎症中的细胞和组织表达。免疫细胞，巨噬细胞和树突细胞均可以在特定的刺激下产生IL⁃33［11］。已知IL⁃33 是ST2 的配体，并且在免疫应答和炎性疾病中起重要作用。除了Th2 型免疫反应外，最近的研究表明，IL⁃33 通过促进自然杀伤和自然杀伤T 细胞分泌Th1 型细胞因子，对Th1 型反应有显着影响。 IL⁃1 受体相关蛋白ST2 和IL⁃1 受体辅助蛋白（IL⁃1RAcP）是IL⁃33 介导的信号转导所必需的受体，研究表明，在病变的肺组织中可检测到高表达水平的IL⁃33，表明IL⁃33 其在呼吸系统疾病中起重要作用。既往研究［12］已经显示虽然已报道COPD 患者的血清ST2 和IL⁃33 水平升高，但EBC中的IL⁃33 在COPD 的表达水平和与临床疾病关系仍未明确。高达40%的慢阻肺患者中发现类似哮喘患者的嗜酸粒细胞的气道炎症，虽然研究［13］表明嗜酸性粒细胞可能通过参与自身免疫失衡而参与慢阻肺的病理生理进程，但对于COPD 中嗜酸性粒细胞的功能仍未明确。本研究中，明确了在COPD 患者中EBC 中的IL⁃33 水平显著增高，且与气道诱导痰的嗜酸性粒细胞比例以及血清多项炎症因子水平呈显著的正相关，表明了IL⁃33 参与了COPD 的炎症反应，并潜在参与COPD 患者嗜酸性粒细胞的激活。

既往有研究通过检测到肺组织的IL⁃33 表达水平显著增高，表明IL⁃33 上调可能参与系统性炎症和COPD 气道炎症［14］。本研究采用ELISA 法检测了COPD 和健康参与者的EBC 中的IL⁃33 表达水平，结果显示了COPD 患者其EBC 中的IL⁃33 水平显著升高，且IL⁃33 表达水平与COPD 患者的分期和分级情况密切相关，这也从另一种检测手段确认了IL⁃33 参与COPD 患者的机体发病机制。本研究中也检测了所有参与者中的血清IL⁃33 表达水平，且血清IL⁃33 与EBC 中的IL⁃33 表达水平相关系数达到了0.778，表明了EBC 的IL⁃33 表达水平能反映患者血清的IL⁃33 表达水平。同时，对血清检测的进一步结果显示其IL⁃6、IL⁃8 和TNF⁃α水平均显著升高，同时气道中嗜酸性粒细胞比例也显著升高，这与既往研究结果相一致。既往研究显示，在呼吸道刺激物刺激下，IL⁃33 和ST2 在小鼠肺组织中显著高表达，其伴有中性粒细胞和巨噬细胞渗透增多，显示了IL⁃33 是气道炎症中的细胞因子和趋化因子。且研究［15］结果证明了EBC 中的IL⁃33 蛋白是可检测的，EBC 中的IL⁃33 水平与气道嗜酸性粒细胞比例、IL⁃6、IL⁃8 和TNF⁃α呈显著的正相关证明了气道EBC 能良好地反应COPD 患者的全身炎症指标状态。有研究显示IL⁃33 可以通过ST2 受体促进COPD 患者的IL⁃6 和IL⁃8 的产生参与早期的抗炎调节机制。COPD 患者气道中嗜酸粒细胞增多，且嗜酸性粒细胞中也存在ST2 的表达，因此，IL⁃33 可通过ST2 激活嗜酸性粒细胞导致产生超氧化物和IL⁃8等炎症因子，维持嗜酸性粒细胞存活。这可能是IL⁃33与气道嗜酸性粒细胞呈显著正相关的主要原因。因此，针对嗜酸性粒细胞在COPD 的重要作用，通过抑制IL⁃33 介导的嗜酸性粒细胞激活有可能成为控制COPD 患者炎症进展的重要途径，但对于气道中IL⁃33 具体介导嗜酸性粒细胞激活的机制仍需要进一步深入研究。

综合上述，本研究结果表明了COPD 患者呼出气冷凝液IL⁃33 的表达水平显著增高，气道IL⁃33参与了COPD 患者的病情进展，且与气道和外周血中的嗜酸性粒细胞比例及血清IL⁃6、IL⁃8 和TNF⁃α水平显著相关。