伍恒英 彭苏珺 布俏雯 张亮 王三锋 雷雯 李辉斌 马健 罗喜平

广州医科大学附属广东省妇幼保健院妇科（广州510010）

宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，其发病率在女性生殖器官恶性肿瘤中排第2 位，其中约90%的宫颈癌死亡发生在发展中国家。研究［1］表明，宫颈癌患者中HPV 感染的概率达到了99%，而且高危型HPV（high risk human papillomavirus，hr⁃HPV）感染是导致宫颈癌的必要因素，因此针对HPV 感染的检测和治疗手段已经开展并得到广泛应用。HPV+TCT（液基薄层细胞学检查）的检测方法和HPV 疫苗的使用，使宫颈癌成为可预防的恶性肿瘤。研究［2-3］表明，无论何种检测方法，仍有一小部分宫颈癌患者HPV 的检测结果为阴性，并提出HPV 阴性宫颈癌可能代表生物学上，与HPV阳性宫颈癌相比预后较差的肿瘤亚群。现行依靠HPV 的宫颈癌筛查方法存在较大的漏诊风险，因此，寻找能够区别于HPV 之外，有效识别宫颈癌的特异性分子标志物，补充目前hr⁃HPV 阴性宫颈癌易漏诊的不足，具有重要意义。研究［4］表明DNA启动子甲基化是恶性肿瘤发生的早期事件，且与宫颈癌的发生发展密切相关，可作为宫颈癌早期诊断的特异性分子标志。具有序列相似性的19 家族［趋化因子（C⁃Cmotif）-样］成员A4（family with sequence similarity 19 member A4，FAM19A4）是TAFA 基因家族成员，国外已有研究［5］发现FAM19A4 基因启动子甲基化能有效识别宫颈癌，有望成为新型肿瘤标记物。但国内外目前尚无文献报道FAM19A4 基因启动子甲基化与hr⁃HPV阴性宫颈癌相关性的研究。为探讨FAM19A4 基因启动子甲基化在我国妇女hr⁃HPV 阴性宫颈癌诊断中的价值，在前期研究基础上，本文采用双探针荧光定量PCR 技术，检测hr⁃HPV 阴性及阳性宫颈癌甲基化检出率，研究FAM19A4 基因启动子甲基化在hr⁃HPV 阴性宫颈癌诊断中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年6月至2017年5月在我院治疗的宫颈癌患者。本研究的纳入标准为：病理切片经我院病理科确诊或会诊的宫颈癌患者，临床分期及治疗方式均以国际妇产科联盟（FIGO，2009年）为依据。排除标准为：（1）病理切片未经我院病理科会诊；（2）同时发现两种及两种上妇科恶性肿瘤；（3）未按照国际妇产科联盟（FI⁃GO，2009年）未标准进行治疗，无法获取病理石蜡作为样本。符合入选条件共490 例。从中筛选出术前宫颈刷液HPV 检测结果为高危型阴性宫颈癌患者25 例为实验组，从中随机选择3 例术前宫颈刷液HPV 检测结果为高危型阳性宫颈癌患者为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的提取 利用TIANamp FFPE DNA 提取试剂盒（北京天根公司生产）提取石蜡包埋标本的DNA，按试剂盒说明书提供的方法操作。以上提取的DNA 使用Quawell Q5000 紫外分光光度计进行浓度测量，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 HPV⁃DNA 高通量测序 由北京迈基诺基因科技股份有限公司完成，基本过程，将提取的DNA，捕获目的一部分进行样品文库的制备，进一步对该文库进行质量检测，捕获目的DNA 片段，使用NextSeq500、HiSeq2500（Rapid）测序仪测序，测序策略为PE150，进行最后的信息分析，得到最终的样本信息。

1.2.3 定量PCR 检测 重亚硫酸盐修饰将剩余的DNA 进行重亚硫酸氢盐处理（模板DNA 浓度为500 ng），利用EZ DNA Methylation⁃DirectTM试剂盒（美国Zymo Research 公司产品），按试剂盒说明书提供的方法操作。重亚硫酸盐修饰后的DNA 立即用于荧光定量PCR 检测，剩余样本储存在-20 ℃冰箱。

1.2.4 双探针荧光定量PCR 美国ABI 7500 型实时荧光定量PCR 系统（Life Tech）用于进行实时荧光定量PCR 技术检测样本中FAM19A4 基因的甲基化情况。以hr⁃HPV 阳性宫颈癌FFPE⁃DNA、hr⁃HPV 阴性宫颈癌FFPE⁃DNA、双蒸水分别作为阳性对照、阴性对照和空白对照模板。反应体系共20 μL，主要包括：2 × Premix Type 试剂10 μL；50 × Rox Reference Dye II 试剂0.2 μL；FAM19A4基因上、下游引物各0.5 μL；ACTB 内参基因上、下游引物各0.5 μL；FAM19A4 基因及ACTB 内参基因探针各0.8 μL；纯水5.2 μL；样本量1 μL（FAM19A4 基因及ACTB 内参基因的引物及探针序列如表1所示）。PC反应条件：95°C预变性3 min；然后95 ℃变性15 s，56 ℃退火20 s 及65 ℃延伸40 s，共进行50 个循环。每个样本均进行了3 次重复试验。扩增结果判定：荧光定量PCR 技术扩增后，经ABI 7500 收集荧光信号，获得内参基因和目标基因的循环阈值（CT 值）及扩增曲线，计算两基因CT 值间的阈值差（ΔCT），综合判定不同样本的甲基化程度。以ACTB 为内参，计算ΔCT=CT 目标基因-CT 内参，并同时结合扩增曲线判断甲基化情况，且ΔCT 值越小，扩增曲线目标基因越早扩增，表示基因甲基化水平越高。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验或连续校正或Fisher 精确概率法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量检测HPV 病毒 25 例宫颈癌样本经过荧光定量PCR、HC⁃II 两种方法检测HPV 病毒感染情况，12 例（48.0%，12/25）为hr⁃HPV 阴性，二者检测结果相仿。将12 例样本作进一步高通量测序，最后结果见表2。实验组中12 例样本仅剩余9 例为hr⁃HPV 阴性，对照组中3 种检测方法型别完全吻合。对照组3 例样本经3 种检测方法检测，HPV 结果吻合。

表1 FAM19A4 及ACTB 基因的引物及探针序列Tab.1 The sequences of primers and probes for the FAM19A4 and ACTB genes

表2 样本组织学类型，以及经HC⁃II、荧光定量PCR、高通量靶向测序检测结果Tab.2 Sample histology type，as well as HC⁃II，qPCR，High⁃throughput sequencing test results

2.2 hr⁃HPV 阴性与hr⁃HPV 阳性宫颈癌患者的临床病理特点比较 表3显示hr⁃HPV 阴性及阳性宫颈癌的女性在FIGO 分期、组织病理学、淋巴转移情况的比较。临床分期：490 例宫颈癌患者中，早期共162 例，其中hr⁃HPV 阴性8 例，hr⁃HPV 阳性348 例；局部晚期共312 例，其中hr⁃HPV 阴性1 例，hr⁃HPV 阳性117 例。临床分期中hr⁃ HPV 阴性与阳性患者的构成比分别比较，差异没有统计学意义（P＞0.05）。病理类型：490 例子宫颈癌患者中，鳞癌共387 例，hr⁃HPV 阴性6 例，hr⁃HPV 阳性381例；腺癌共38 例，hr⁃HPV 阴性3 例，hr⁃HPV 阳性35例。腺癌中hr⁃HPV 阴性的比例明显高于hr⁃HPV阳性患者（P＜0.05）。淋巴转移情况：490 例子宫颈癌患者中，有明确的淋巴转移情况记录共233例，淋巴转移共40 例，hr⁃HPV 阴性2 例，hr⁃HPV阳性38例；淋巴未转移193例，hr⁃HPV阴性7例，hr⁃HPV阳性186例。淋巴转移情况中hr⁃HPV 阴性与阳性患者的构成分别比较，差异没有统计学意义（P＞0.05）。

表3 hr⁃HPV 阴性与hr⁃HPV 阳性宫颈癌患者的临床病理特点比较Tab.3 Comparison of clinicopathological features of hr⁃HPV⁃negative and positive cervical cancer patients 例

2.3 hr⁃HPV 阴性与hr⁃HPV 阳性宫颈癌及空白对照样本的扩增曲线 采用双探针荧光定量PCR 分别检测hr⁃HPV 阴性与hr⁃HPV 阳性宫颈癌组织FFPE 中，FAM19A4 基因启动子发生甲基化的情况，发现在hr⁃HPV 阴性与阳性宫颈癌的样本中甲基化检出率都是100%。见图1。

图1 高危型HPV 阴性、阳性宫颈癌及空白对照样本的的扩增曲线Fig.1 qMS⁃PCR amplification curve of high⁃risk HPV⁃negative and positive cervical cancer and blank control samples

3 讨论

宫颈癌是中国女性最常见的恶性肿瘤之一，1974年德国病毒学家ZURHAUSEN等［6］提出了HPV 可能在子宫颈癌的发病过程中起到重要作用的观点，HPV 与宫颈癌的研究便在国内外从未停止，目前普遍认知hr⁃HPV 的持续性感染是宫颈癌发病的主要原因，HPV 检测已经被纳入宫颈癌的筛查方案。临床上关于hr⁃HPV 阴性宫颈癌的报道也不少见，HPV 感染阴性率也是层出不穷，且有报道［7］hr⁃HPV 阴性宫颈癌的发病率不断升高。RODRÍGUEZ⁃CARUNCHIO 等［8］研究显示，用HC⁃II方法初次检测子宫颈癌患者的HPV 感染状况，其阴性率为10.2%，当再次用高敏感度的PCR 技术重复检测时，其阴性率减少为5.8%。与本研究结果相似，说明，检测方法的不同是导致子宫颈癌患者HPV 感染阴性率报道大相径庭的原因之一；也提示，临床应选用敏感的HPV 检测方法进行子宫颈癌筛查。在本研究中使用高通量测序的检测方法，证明存在宫颈癌存在hr⁃HPV 阴性的可能，然而采用高通量测序的方法去进行hr⁃HPV 阴性宫颈癌的诊断，在临床投入使用的可行性较差，经济性、效率等方面存在着明显的不足，那么寻找一种对HPV 检测更加精准，又或者能独立于HPV 病毒之外的宫颈癌的筛查方法显得尤为重要。

高危型HPV 感染是宫颈癌及其癌前病变的主要致病原因，hr⁃HPV 还能诱导宿主细胞发生遗传及表观遗传学的改变导致癌变［9］。那么通过表观遗传学进行肿瘤早期诊断是否能成为一条新的检测路径？DNA甲基化是最常见的表观遗传学之一，通过检测表观遗传学的变异，诊断肿瘤具有更高的稳定性、灵敏度和特异度。STEENBERGEN 等［9］首先使用人染色体核型分析技术在宫颈组织水平验证了FAM19A4 基因启动子甲基化有望作为宫颈癌的新型靶向分子标记物。研究［10］发现，正常宫颈相比，FAM19A4 基因甲基化检出率在宫颈癌中异常增高，能有效的检测宫颈癌。FAM19A4 基因甲基化可能促进宫颈癌的发生发展，是宫颈细胞癌变的特异性生物标志物。在本研究中，对照组及实验组的hr⁃HPV 阳性宫颈癌及阴性宫颈癌甲基化检出率没有差异。因此推测，甲基化诊断宫颈癌的的检测方法能够不受HPV 的干扰，尤其是在hr⁃HPV 阴性宫颈癌的诊断优势更加突出。因此甲基化的检测方法在宫颈癌筛查中的意义不容忽视。

本研究与先前报道的结果一致，hr⁃HPV 阴性更常见于腺癌［11-12］。这可能与宫颈腺癌的亚型较多，HPV 检测无法完全覆盖有关，甚至有学者［13］提出宫颈腺癌致病原因是HPV 以外的病原体引起。hr⁃HPV 阴性宫颈癌的发病机制尚不明确，仍需进一步研究。本研究还发现在临床分期中本研究中hr⁃HPV 阴性宫颈癌患者的临床分期更偏早期，这与FISCHEROVÁ等［14］研究结果相反。推测是因为宫颈癌的不断进展，HPV 病毒脱失，进而造成晚期宫颈癌hr⁃HPV 检测结果呈阴性。研究［15］发现FAM19A4 基因甲基化可能与病理类型、临床分期及淋巴结转移状态无关。因此，hr⁃HPV 阴性宫颈癌是一种临床病理较为特殊的宫颈癌，将甲基化检测用于它的诊断，能够减少临床病理不同带来的影响，减少漏诊风险。

综上所述，本研究从宿主基因水平的变化表明了宫颈组织可能受表观遗传影响发生癌变，突破传统的宫颈癌伴随着高危型HPV 感染的观念。本研究的主要优势在于使用荧光定量PCR、HC⁃II、高通量测序多种HPV 检测方法重复检测样本HPV感染情况，且以高通量测序为金标准，进行分析，探讨FAM19A4 基因甲基化在hr⁃HPV 阴性宫颈癌诊断中的作用。本研究的主要局限是样本量较少，需要更大的样本量，减少实验中可能存在的偏倚；而且FEEP 样本提取DNA 过程中，有可能出现HPV 病毒脱失或者病毒已被免疫机制清除等可能，导致取材受到影响。未来研究中将继续收集高危型HPV 阴性宫颈癌组织及宫颈细胞刷液样本进行分析，减少统计结果中的偏倚，希望将该基因甲基化检测应用在高危型HPV 阴性宫颈癌的早期诊断中。