朱元媛 闫洪超 刘永利 李欣

1徐州医科大学研究生学院（江苏徐州221002）；2徐州医科大学附属医院妇产科（江苏徐州221006）；3徐州医科大学附属徐州市第一人民医院妇产科（江苏徐州221002）；4徐州医科大学附属徐州市妇幼保健院妇科（江苏徐州221009）

上皮性卵巢癌是女性生殖系统肿瘤中病理类型最多且最复杂的恶性肿瘤之一，疾病发病率逐年升高，发病年龄年轻化，早期即可出现盆腔腹膜转移及淋巴结转移，在女性生殖系统恶性肿瘤中，病死率最高［1］，上皮性卵巢癌的诊断及治疗已成为研究热门。新近研究发现，T 细胞包含抗病毒及抗肿瘤功能，多种免疫抑制受体参与T 细胞免疫调控［2］，如淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene⁃3，LAG3）、PD⁃1、CTLA⁃4、B 和T 淋巴细胞弱化因子（B and T lymphocyte⁃attenuator，BTLA）和T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM3）［3］，抑制免疫检测点功能，可提高T 细胞抗肿瘤作用，因而免疫抑制剂占有愈来愈重要的地位。QUAN等［4］、SEKAR 等［5］、LAN 等［6］在血液肿瘤、乳腺癌小鼠模型及胃癌中证实BTLA 高表达。PARRA等［7］研究LAG3 在肺癌中高情况。TIM3 证实高表达于前列腺癌细胞［8］、肝癌细胞［9］。迄今为止，在人类实体肿瘤来源的细胞中分析了BTLA、LAG3、TIM3 等共抑制分子［10］，在上皮性卵巢癌的表达情况的研究罕见。本文首次探讨和研究卵巢癌中BTLA、LAG3、TIM3 的表达情况，证实其高表达及作为免疫检测点的意义，为免疫抑制剂的制作提供参考。本文应用免疫组化PV法检测了拥有有效随访资料的卵巢上皮性癌患者的卵巢组织，研究LAG3、BTLA 和TIM3 在卵巢癌组织中的表达，以探讨其在卵巢癌中的表达及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集徐州医科大学附属医院、徐州医科大学附属徐州市妇幼保健院及徐州医科大学附属徐州市第一人民医院在2010年1月至2013年1月期间通过手术治疗的有随访资料的上皮性卵巢癌患者在病理科的组织蜡块，共84 例，4 例失访，80 例包括卵巢浆液性腺癌56 例，黏液性腺癌20 例，子宫内膜样腺癌4 例。同时收集38 例良性上皮性卵巢肿瘤组织蜡块，包括27 例浆液性囊腺瘤，11 例黏液性囊腺瘤。12 例交界性上皮性卵巢肿瘤组织蜡块。并随机选取同期因子宫肌瘤切除的正常卵巢组织30 例。纳入标准：患者拥有完整的临床信息及病理资料；术后及时随访。排除标准：除外合并其他系统恶性肿瘤；除外转移自生殖系统其他器官的恶性肿瘤；除外首次治疗方案为化疗、放疗或内分泌治疗。患者手术日期为随访起点，死亡日为随访终点，2018年1月为随访截止日期。标本均取自病理科且经病理确诊，10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm 切片。上皮性卵巢癌患者以FIGO 分期，WHO 组织学分级。随访总时间为3.1～63.2 个月，中位生存时间为30.4个月。本研究均经伦理委员会批准，且获得患者及家属知情同意。

1.2 实验试剂 BTLA 兔抗人多克隆抗体、TIM3鼠抗人多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；LAG3 鼠抗人多克隆抗体购自美国abcam 公司；超敏兔及鼠两分法试剂盒（PV⁃9001）、DAB 试剂盒购自北京中衫金桥公司。

1.3 实验方法 采用免疫组化PV 法，将所有标本石蜡切片至于二甲苯及梯度乙醇脱腊水化，PBS浸泡，枸橼酸盐缓冲液抗原修复，冷却至室温，去除内源性过氧化物酶活性。特异性一抗（浓度为1∶50 的BTLA 兔抗人；浓度为1∶50 的LAG3 兔抗人；浓度为1∶50 的TIM3 鼠抗人；）滴于标本玻片4 ℃过夜，恢复室温后再滴加特异性生物素化二抗，辣根溶液覆盖玻片样本，滴加DAB 显色剂，苏木素染色，梯度酒精及二甲苯脱水，中性树胶封片，于400 倍显微镜下观察结果。

1.4 结果判定 以染色强度结合阳性细胞数占总细胞数的百分比进行半定量分析。BTLA、LAG3和TIM3 均表达于细胞膜，呈棕黄色颗粒。染色强度分四度：不着色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分。镜下阳性细胞数百分比分四度：＜1%计0 分，阳性细胞百分比1%～30%计1 分，30%～70%计2 分，70%～100%计3 分。每张切片分析时将两项分数相加，1～2 分为弱阳性（+），3～4 分为中阳性（++），5～6 分为强阳性（+++），0 分为阴性（-）。

1.5 统计学方法 所有统计数据分析时，应用SPSS 25.0 统计学软件，免疫组化阳性表达情况行卡方检验，BTLA、LAG3、TIM3 分别与临床病理因素同样采用卡方检验分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。采用Kaplan⁃Meier 寿命表法行单因素生存分析绘制生存曲线、COX 比例风险模型进行多因素生存分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BTLA、LAG3 和TIM3 在卵巢组织中的表达 正常卵巢组织、良性、交界性上皮卵巢肿瘤及上皮性卵巢癌中BTLA 的阳性率分别为0%、31.6%、50%、91.25%；LAG3 的阳性率分别为16.7%、34.2%、83.3%、87.5%；TIM3 的阳性率分别为10%、47.4%、83.3%、95%。差异有统计学意义，呈上升趋势（P＜0.001）。见图1～3。

图2 LAG3 在不同组织中表达（IHC×400） Fig.2 Expression of LAG3 in different tissues

图3 TIM3 在不同组织中表达 Fig.3 Expression of TIM3 in

2.2 BTLA、LAG3 和TIM3 与卵巢癌临床病理因素的差异分析 早期（Ⅰ/Ⅱ期）上皮性卵巢癌BTLA、LAG3 和TIM3 的表达阳性率低于晚期（Ⅲ/Ⅳ期），差异具有统计学意义（P=0.004、0.01 及0.023），表明期别越晚，阳性表达率越高。有淋巴结转移者，BTLA、LAG3 和TIM3 的阳性表达率越高（P=0.016、0.036 及0.002）。LAG3 表达与组织学分级呈负相关，分级越高，分化程度越低，阳性表达率越高（P=0.017），而BTLA 及TIM3 与组织学分级无明显相关性（P=0.786 及0.126）。BTLA、LAG3、TIM3 与年龄（P=0.759、0.383 及0.596）、组织学类型（P=0.809、0.052 及0.165）及腹腔转移（P=0.553、0.091 及0.124）无关，差异无统计学意义（P＞0.5）。

2.3 BTLA、LAG3和TIM3的表达与卵巢癌患者的生存分析 应用Kaplan⁃Meier 法寿命表法，BTLA阴性表达的患者生存曲线明显高于阳性表达组，BTLA 表达（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存时间为51.1、29.4、30.0、28.2 个月，整体比较差异有统计学意义（P=0.004），两两比较发现阴性与阳性表达差异有统计学意义（P=0.015、0.002、0.001），不同程度阳性表达间差异无明显统计学意义（P=0.084、0.758、0.793），预后差。LAG3 表达（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存时间为49.1、31.0、29.8、25.6 个月，整体比较差异有统计学意义，两两比较发现阴性与阳性表达差异有统计学意义（P=0.016、0.002、0.000），不同程度阳性表达间差异无明显统计学意义（P=0.521、0.116、0.189），预后差。TIM3 表达（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存时间为56.4、34.2、31.7、28.4 个月，整体比较差异有统计学意义（P=0.001），两两比较发现阴性与阳性表达差异有统计学意义（P=0.023、0.008、0.001），不同程度阳性表达间差异无统计学意义（P=0.367、0.130、0.377），预后差。见图4。

图4 BTLA，LAG3 及TIM3 表达与卵巢癌患者的生存分析Fig.4 Survival Analysis Of Patients Whose BTLA，LAG3 And TIM3 Positive Expression

2.4 BTLA、LAG3 和TIM3 的表达与卵巢癌患者的Cox单因素及多因素生存回归分析 单因素生存分析提示，生存时间与FIGO分期（P＜0.01）、淋巴结转移（P＜0.01）、LAG3（P＜0.01）、TIM3（P＜0.01）、BTLA（P=0.004）蛋白的阳性表达有关（P＜0.05）。而与年龄（P=0.75）、组织学分级（P=0.951）、组织学类型（P=0.77）、有无腹水（P=0.13）无关。将BTLA、LAG3、TIM3 分别纳入FIGO 分期、淋巴结转移的Cox 多因素生存分析回归模型，提示淋巴结转移、BTLA、LAG3、TIM3为累积生存率的独立危险因素（P＜0.01）。BTLA、LAG3、TIM3 阴性表达的患者相对危险度比阳性表达的患者低，且随阳性表达率的升高，相对危险度升高，预后变差（P＜0.01）。

3 讨论

上皮性卵巢癌是目前病死率最高的女性生殖系统恶性肿瘤，往往因为缺乏有效的早期诊断方法，多于晚期发现，且无有效的治疗方法，大大降低患者生存率及生存时间。当前，针对上皮性卵巢癌的治疗，多以手术为主，化疗为辅，而免疫抑制剂的使用为许多恶性肿瘤的治疗带来了福音。

BTLA 属于CD28 家族新成员［11］，在活化T 细胞尤其是Th1 细胞高表达［4］，与其配体疱疹病毒进入介质（HVEM）相互作用时产生免疫抑制效应，负性调控淋巴细胞，抑制T 细胞活化，起到抗肿瘤作用［12］。目前的研究是首次使用免疫组化方法在卵巢癌组织中检测BTLA，正常组织中无明显BTLA阳性表达，在上皮性卵巢癌组织中BTLA 表达情况高于良性上皮性卵巢肿瘤，同样高于交界性上皮性卵巢肿瘤，证实BTLA 表达与卵巢癌相关，且随上皮性卵巢癌FIGO 分期增加、淋巴结转移范围扩大，其阳性表达率越高，预后越差。从单因素和多因素分析显示，BTLA 作为卵巢癌患者独立预后因素具有重要指向性作用，推测BTLA 过度表达导致较差的预后，因为T 细胞活化的下调程度较大，可通过检测BTLA 表达情况推测患者预后，阻断BTLA 途径可能是治疗卵巢癌的新方法。

LAG⁃3 为免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，与配体MHC⁃II 类分子结合能够抑制T 细胞的成熟、分化及增殖，造成癌细胞免疫逃逸［13］，LAG3 高表达于Th1 细胞，通过抗LAG3 抗体阻断LAG⁃3 可以恢复Th1 细胞功能，增强肿瘤坏死因子IFN⁃γ 的分泌及其细胞毒性作用［14］。目前国内针对LAG3 在女性恶性肿瘤上皮性卵巢癌还尚未有研究报导。本研究发现，应用免疫组化法证实80 例上皮性卵巢癌组织中的LAG3 分子的表达情况，表达率高于正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤及交界性上皮性卵巢肿瘤。恶性卵巢癌中的阳性表达率为87.5（70/80），其中强阳性表达者为47.5（38/80），与PARRA 等［7］在肺癌中的研究结果一致。本次研究结果，LAG3 的表达水平与上皮性卵巢癌的分期、分级及淋巴结转移有关。临床病理分期越晚，病理分级越高，分化越低及淋巴结的转移者，其阳性表达率越高，生存率越低，提示其可能作为判断预后的指标，LAG3 高表达减弱肿瘤免疫及抑制作用，参与卵巢癌的发生，并与恶性程度相关。

TIM3 为KUCHROO 等［15］发现的新型基因家族成员，与半乳糖凝集素-9 相互作用可导致Th1细胞和Tc1 细胞凋亡［16］，抑制T 细胞生长及增殖，减弱其分泌细胞因子能力及增殖能力［17］，TIM3 失活，T 细胞抗肿瘤作用也增强［18］。本研究发现，TIM3 表达在正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤、交界性上皮性卵巢肿瘤及上皮性卵巢癌中表达递增，差异有统计学意义，TIM3 在上皮性卵巢癌组织中高表达，且随FIGO 分期的期别增加、淋巴结转移范围扩大，其阳性表达程度递增，平均生存时间缩短，预后较差。依据单因素及多因素分析，TIM3 可作为判断卵巢癌预后的独立危险因素，通过检测TIM3 可作为卵巢癌早期诊断的相对可靠指标。

本研究发现，BTLA、LAG3、TIM3 的阳性表达情况与上皮性卵巢癌的生存时间呈负性相关，且根据多因素相关分析，得出BTLA、LAG3、TIM3 为影响卵巢癌预后的独立危险因素，据此推测，检测BTLA、LAG3、TIM3 可作为判断上皮性卵巢癌患者预后的特异性肿瘤因子，有益于上皮性卵巢癌的早期筛查及早期诊断。BTLA、LAG3、TIM3 作为免疫检测靶点已证实在上皮性卵巢癌组织中高表达，其参与T 细胞的负性免疫调控，抑制BTLA、LAG3、TIM3 的活性，可以增强T 细胞抗肿瘤作用，阻断BTLA、LAG3、TIM3 途径可作为新的免疫抑制治疗，大大提高患者生存率。本研究样不足之处在于样本量较小，其在卵巢癌中的意义及作用仍需加大样本进一步研究。