徐婧玥 张贺平 李洪娟 马晓芳 李艳霞 刘晓智

天津市第五中心医院1检验科，2中心实验室（天津300450）

肺癌是世界上病死率最高的恶性肿瘤之一，因治疗效果差，术后易复发，其发病率和病死率呈持续上升趋势［1-2］。随着免疫治疗与靶向治疗的兴起，寻找潜在基因及新的治疗靶点显得尤为重要。WFDC2（WAP type four disulphide core protein 2）也称人附睾蛋白4（human epididymis protein 4）是一个新的基因，目前对HE4 的研究多集中于卵巢癌诊断方面，并对其作用机制进行了初步探讨，发现其与卵巢癌细胞侵袭、增殖及凋亡生物学行为密切相关［3-5］。随着人们对该基因的认识发现其在肺癌中也呈现高表达状态［6-9］，但与肺癌发展机制的相关研究尚未明确。本文通过特异性小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）技术，观察沉默WFDC2 对肺癌细胞系增殖侵袭的影响，以期为肺癌的治疗提供新的研究线索。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人源性A549 细胞株购自美国ATCC公司。3条干扰序列分别为（1）siRNA⁃WFDC2a 5′⁃GCTCTCTGCCCAATGATAAGG⁃3′，（2）siRNA⁃WFDC2b 5′⁃GTGTCCTG⁃GCCAGATGAA⁃ATG⁃3′，（3）siRNA⁃WFDC2c 5′⁃GATGAAATGCTGCCGCAAT⁃GG⁃3′；siRNA 序列购自南京生物有限公司；兔抗人多克隆HE4 抗体购自美国Abcam 公司；兔抗人β⁃actin 单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的山羊抗兔单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；细胞转染用脂质Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；CCK8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；胎牛血清为浙江天杭生物科技有限公司；RPMI1640 培养基、胰蛋白酶及opti⁃MEM 培养基均购自购自美国Gibco 公司；transwell 小室购自Corning 公司；Matrigel 基质胶购自美国BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染、分组 液氮中取出细胞系A549、复苏后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 完全培养基，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下传代培养。将对数生长期细胞接种于6 孔板中，细胞密度约为60%时，按照LipofectamineTM2000 脂质体转染说明书进行转染，培养6 h 后更换含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，培养48 h后收集细胞。分组：（1）空白组：正常培养肺癌细胞系未做转染（control）；（2）阴性对照组：转染非特异性siRNA（siR⁃neg）；（3）siRNA⁃WFDC2 组：转染人WFDC2 序列特异性siRNA（siR⁃WFDC2）。

1.2.2 RT⁃PCR 检测细胞mRNA 的表达 转染48 h 后，依据Trizol RNA 提取试剂盒说明书分别对A549 各组细胞进行总RNA 提取，按照反转录试剂盒说明书将其合成CDNA。进行RT⁃PCR，上游引物序列5′⁃GCTGTTCGGCTTCACCCT⁃3′，下游引物序列5′⁃TGCGGCAGCATTTCATCT⁃3′，GAPDH 为内参。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30 个循环。每个样品设置两个平行管。

1.2.3 Western Blot 检测细胞中蛋白表达 转染48 h 后，提取总蛋白，常规电泳、转膜，5%脱脂奶粉37 ℃，摇床40 min。然后，各组分别加入（1∶100）HE4 抗体，以（1∶1 000）β⁃actin 作为内对照，4℃水平摇床过夜。次日1∶2 000 稀释二抗室温孵育1 h。胶片显色后利用Gel Doc 1000 成像系统及分析软件进行图像扫描和分析。

1.2.4 CCK8 检测细胞增殖能力 转染48 h 后收集细胞制备单细胞悬液，接种于96 孔板中加入CCK8 试剂。每个细胞设置5 个复孔，一个空白孔（只加培养基），分别于0、1、2、3、4、5 d 各取一块板，使用酶标仪测定450 nm 处的OD值，绘制细胞生长曲线。

1.2.5 细胞划痕实验 将转染48 h 的A549 细胞接种于6 孔板转天长满进行划痕实验，100 倍倒置荧光显微镜观察记录每组划痕两侧初始距离，记为S0（每组随机选取5 个点，做好标记），无血清培养基培养48 h 后终止实验，再测量两侧细胞间距离S1。细胞迁移距离=S0-S1。

1.2.6 体外侵袭实验 将-20 ℃Matrigel 基质胶置于4℃冰箱中过夜成液态，在Transwell 上室铺胶，将对数期生长的各组细胞常规法用无血清培养基制备成单细胞悬液，取100 μL 细胞悬液（5 × 104个）加入Transwell小室，下室中加入500 μL完全培养基，培养24、48 h 后，用棉签小心擦去微孔膜内层的细胞，固定，染色，PBS 洗两次，附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下（× 200）随机观察6 个视野计数，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0 软件进行统计分析，计量资料采用，组间均数比较采用t检验，多组间经单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549 细胞转染后WFDC2 mRNA 和蛋白表达 RT⁃PCR 和Western blot 实验检测结果显示，经siRNA⁃WFDC2 转染后，A549 细胞中WFDC2 mRNA水平和蛋白表达较空白组（control）和阴性对照组（siR⁃neg）显著降低（P＜0.05）。见图1。

2.2 细胞增殖情况 与空白组和阴性对照组相比，随着培养时间的增加，siRNA⁃WFDC2 组A549 细胞增殖能力显著降低（P＜0.05）；control 组与siR⁃neg组差异无统计学意义。见图2。

2.3 转染后A549 细胞迁移能力 细胞划痕实验显示，空白组、阴性对照组和实验组的细胞迁移距离分别为（533.12±44.27）μm、（508.12±67.31）μm和（266.24 ± 55.02）μm，实验组与空白组和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 转染后A549 细胞侵袭能力 Transwell 实验细胞接种后的24 h 和48 h，实验组与空白组和阴性对照组相比细胞迁移数量显著减少（P＜0.05）。见图4，表1。

3 讨论

WFDC2基因定位于人染色体20q12⁃13.1 上，全长约12 kb，包含4 个内含子和5 个外显子，属于乳酸清蛋白（WAP）家族成员，这一基因家族中研究较多的是分泌性白细胞蛋白酶抑制因子（SLPI）和弹性蛋白酶抑制剂（elafin），WAGENBLAST 等［10］研究提示SLPI是肿瘤血管拟态的驱动因素，同时发现其充当抗凝剂作用可能会促使红细胞进入肿瘤及癌细胞进入血液而导致肿瘤的增殖与扩散；LU等［11］研究提示HE4 能直接促进肿瘤细胞DNA 合成、调节PCNA和p21的表达。HE4含有2个高度保守的WAP 结构域使其具有蛋白酶抑制剂的活性参与肿瘤转移、侵袭等过程［12］。有研究表明HE4影响了上皮性卵巢癌细胞粘附、增殖、侵袭、迁移［13］，RIBEIRO 等研究提示［14］，HE4 在过表达的卵巢癌细胞系SKOV3 有更高水平的AKT3，因此认为HE4 影响了P23K/AKT 通路途径，而导致肿瘤细胞的增殖及侵袭能力；也有研究显示［15］HE4 能够与EGFR、IGF1R 和转录因子HIF1α相互作用，促进卵巢肿瘤的生长；WFDC2 基因位点与各种恶性肿瘤表达有密切关系，目前文献报HE4 作为血清肿瘤标志物在肺癌的早期诊断及疗效监测有重要的临床应用价值［16-17］，但WFDC2 在肺癌增殖迁移及侵袭及干扰WFDC2 基因的抑癌机制尚不明确。在本实验中，通过siRNA 转染人肺癌A549细胞，经检测发现转染后的细胞中HE4 蛋白及mRNA 表达量均下降，且对细胞增殖速度及细胞迁移率起到了抑制作用与ZHU［18］等在卵巢癌增殖、侵袭及转移研究中生物学行为一致，由此可见该基因可能在肺腺癌的增殖和转移过程中发挥了重要的作用，提示WFDC2 基因有可能成为肺癌治疗的新靶点，本次研究仅选取了肺腺癌细胞系且只探讨了WFDC2 在体外实验中对细胞生物学行为的影响，在今后的研究中应进一步扩展到肺鳞癌及小细胞肺癌细胞系及其对肺癌的侵袭、增殖中的具体作用机制，以期为肺癌的诊断、治疗提供更有力的证据。

图1 siRNA 对A549 细胞中WFDC2 mRNA 和蛋白表达的影响Fig.1 Effect of siRNA on the expression of WFDC2 mRNA and protein in A549 cells

图2 siRNA⁃WFDC2 对A549 细胞增殖的影响Fig.2 Effect of siRNA⁃WFDC2 on proliferation of A549 cells

表1 A549 不同组别24 h 及48 h 迁移细胞数量（个/视野）Tab.1 Number of cells migrating from different groups at 24 and 48 hours（per field of vision）±s

表1 A549 不同组别24 h 及48 h 迁移细胞数量（个/视野）Tab.1 Number of cells migrating from different groups at 24 and 48 hours（per field of vision）±s

注：与空白对照组比较，*P＜0.05

组别空白组阴性对照组实验组迁移细胞数量/24 h 45.71±8.44 50.98±6.24 28.48±7.94*迁移细胞数量/48 h 110.47±15.43 98.73±10.45 54.34±10.73*

图3 划痕实验检测siR⁃WFDC2 转染对A549 细胞迁移能力的影响Fig.3 Effect of siR⁃WFDC2 transfection on migration of A549 cells by scarification assay

图4 Transwell 检测siR⁃WFDC2 转染对A549 细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect of siR⁃WFDC2 transfection on invasion of A549 cells by Transwell assay

综上所述，沉默WFDC2 基因后可有效抑制肺癌细胞系A549 增殖、迁移及侵袭能力，但WFDC2在肺癌细胞增殖、侵袭及凋亡中的具体作用机制尚需进一步的研究，本研究为肺癌的基因诊断及靶向治疗提供了理论基础。