王燕 何朝晖 邓镇涛 彭莉萍 谭静 杨愈丰

1遵义医科大学珠海校区（广东珠海519041）；2遵义医科大学第五附属医院消化内科腔镜中心（广东珠海519041）

当今世界，癌症是人类最主要的死因，也是影响人类寿命的最主要因素。根据权威机构预计，2018年全球新增癌症患者约1.81亿人，死亡人数约960 万人。其中，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）不管是新增患病人数还是死亡人数比例均排第四位［1］。CRC 作为一种常见的消化道癌症，在中国人群中发病率和死亡率也均较高，在中国人群恶性肿瘤中排第五位［2］。90%的早期CRC 患者可以通过手术治愈，但是早期诊断主要依靠肠镜检查，不容易被人接受。晚期或发生远处转移的CRC 患者由于缺少监测指标，不管是手术治疗还是化疗效果均不理想。

长链非编码RNAs（long non⁃coding RNA，Ln⁃cRNAs）通常是指一类长度大于200 核苷酸的长链RNA 分子，通常不翻译成相应的蛋白质产物。近几年已有大量研究表明LncRNAs 能通过直接与细胞内的DNA、RNA 或蛋白相互作用，从而影响DNA 的转录或RNA 的翻译，进而调节细胞周期和凋亡。因此，LncRNAs 也与各种肿瘤的发生发展有着千丝万缕的关系。近年来不断有研究报道在结直肠癌发病的分子机制中LncRNAs 起着至关重要的作用［2］。LncRNAs 可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥着原癌基因或抑癌基因的作用［3］，主要参与肿瘤细胞凋亡、浸润与转移等过程；还可以通过表观遗传调控的方式影响肿瘤细胞的生长。越来越多的证据显示，LncRNAs 有希望成为新型肿瘤标志物和肿瘤治疗靶点，在肿瘤诊断和治疗方面显示出良好的临床应用前景。

笔者在之前的研究工作中利用抑制消减杂交技术分离到一个在乳腺癌中高表达的EST 序列，经序列比对后发现其与CLDND1 的序列相似度为100%。CLDND1 自2002年被NicoleAdeline Fayein发现后，从其预测的蛋白质结构结果把它归类于claudin 膜蛋白多基因家族，命名为含有claudin 结构域的蛋白1（claudin domain containing 1）简称CLDND1［5］，其转录产物主要在神经组织内高表达。但是我们的前期实验结果显示CLDND1 在乳腺癌组织中存在大量转录物，但没有蛋白质水平产物，其功能类似LncRNA，且在乳腺癌的发生发展过程中起重要的作用［6-7］。另有报道发现CLDND1 RNA 在肺癌组织中同样高表达［8］；而在肾细胞癌中，CLDND1 RNA 转录水平异常上调促进了肾肿瘤细胞增殖，并提升其侵袭能力［9］。这些研究结果显示CLDND1 RNA 与多种恶性肿瘤发生具有高度相关性。本文通过检测CLDND1 RNA 在CRC 组织及细胞中的表达差异，并研究该RNA 转录水平变化SW480 细胞生长的影响，探讨CLDND1 RNA 与CRC 发生发展的相关性，为CRC 生物标志物寻和治疗靶点的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者标本、细胞系35 对结直癌及癌旁组织标本均由遵义医学院第五附属医院病理科提供。SW480 细胞系购买于中科院上海细胞库。细胞传代接种于RPMI 1640 培养基（含有10%胎牛血清和青霉素100 U/mL，链霉素0.1 mg/mL）于37℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.1.2 胎牛血清为杭州四季青公司产品，qRT⁃PCR 试剂盒购于美国ABI 公司，FISH 试剂盒购于美国Roche 公司，脂质体Lipofectamine 2000 购于美国Invitrogen 公司。所用反义RNA 由上海吉玛公司合成。其它常规试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 应用qRT⁃PCR 技术检测结直肠癌及癌旁组织标本中CLDND1 差异表达收集50 对经病理检验后的新鲜组织标本，抽提组织总RNA 后经OD260/280 分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性和纯度后，根据ABI 试剂盒操作说明进行逆转录和实时定量PCR 实验。实验重复三次，每次设三个复孔。（CLDND1 引物序列：L1⁃5′ATGGATA⁃ACCGTTTTGCTACA⁃3′，R1⁃5′TCATGCCACACGAT⁃ATGC⁃3′，R2⁃5′TGGTGGGCTATACCAATG⁃3′）。

1.2.2 构建CLDND1 真核表达载体pEGFP⁃C1⁃CLDND1 转染SW480 细胞，过表达CLDND1 选择具有绿色荧光的真核表达载体pEGFP⁃C1，构建CLDND1 的真核表达载体依照lipo2000 转染试剂盒说明步骤转染SW480 细胞，24 h 后荧光显微镜下观察转染效率。以不含CLDND1 的空质粒转染细胞作为对照组。

1.2.3 SW480 细胞中CLDND1 RNAi 实验 为了进一步研究CLDND1 基因的功能，我们根据预测的CLDND1 RNA 二级结构设计并在上海吉玛公司合成了两条反义RNAOligoB1/B2 分别转染结肠癌细胞SW480，取人类不存在的序列RNA 为阴性对照，依照lipo2000 转染试剂盒说明步骤分组转染SW480 细胞，48 小时后收集细胞抽提总RNA，经RT⁃PCR 技术检测干扰效果。

1.2.4 MTT 法分析细胞增殖能力 接种细胞：用含10%胎小牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000 个细胞接种到96 孔板，每孔体积200 μL；培养细胞：同一般培养条件，培养3～5 d（可根据试验目的和要求决定培养时间）；呈色：每孔加MTT 溶液（5 mg/mL 用PBS＜pH7.4 ＞配）20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解；比色：选择490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5 AnnexinV⁃FITC/PI 法分析细胞凋亡 根据美国BD 公司AnnexinV⁃FITC/PI 试剂盒说明说，取上述转染pEGFP⁃C1⁃CLDND1 过表达和RNAi 下调表达CLDND1 后48 h 的SW480 细胞进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 统计学分析 数据分析采用SPSS 19.0 软件进行，计量资料差异比较采用配对样本t检验，多组资料比较采用方差分析，多重比较采用Dunnett检验，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中CLDND1 比癌旁组织表达高 应用qRT⁃PCR 方法对比检测收集的35 对结直肠癌组织及其癌旁组织中CLDND1 表达情况，所有样本的检测均平行重复三次，所得数据都以均数加减标准差（）表示，PCR 扩增后，采集对应的Ct 值，得到结直肠癌组织与癌旁组织的Mean Ct 值及△Ct 值。CLDND1 在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义（t=9.809，P＜0.001）。qRT⁃PCR 结果见图1。

图1 qRT⁃PCR 检测20 对结直肠癌组织及癌旁组织CLDND1 差异表达Fig.1 Differentially expressed CLDND1 in colorectal cancer tissues and adjacent tissues was detected by qRT⁃PCR technology

2.2 MTT 实验显示高表达CLDND1 后SW480 细胞增殖能力增强 SW480 细胞分别转染入pEGFP⁃C1（Control）和pEGFP⁃C1⁃CLDND1 后经荧光显微镜观察可见到60%～80%的细胞表达EGF 荧光蛋白，提示转染成功，过表达CLDND1 后分别取转染前、转染12、24、36、48、72 和96 h 七个时间点加入MTT，测定吸光度，绘制细胞生长曲线，结果如图2所示，过表达CLDND1 细胞组活力大于对照组。

图2 MTT 绘制细胞生长曲线Fig.2 Cell Viability was measured by MTT assay

2.3 RNAi 技术下调SW480 细胞中CLDND1 的表达 图中条带由左至右为M：DNA marker；1：单加转染试剂组；2：转染阴性对照RNA 组；3：转染反义寡核苷酸OligoB1 组；4：转染反义寡核苷酸Oli⁃goB2 组，内参为β⁃actin。以△△Ct 表示SW480 细胞中CLDND1 基因表达量，以2⁃△△Ct表示不同组之间CLDND1 基因差异表达量，组间差别有统计学意义（F=3458.539，P＜0.001），以NC组为基准多重比较结果显示，转染OligoB1 和B2 后，SW480 细胞中CLDND1 基因表达量明显降低（P均＜0.001）。（见图3）

图3 RT⁃PCR 检测SW480 细胞中CLDND1 基因干扰效果Fig.3 RT⁃PCR was used for detecting CLDND1 gene interference effect in SW480 cells

2.5 MTT 实验显示CLDND1 表达降低能抑制细胞生长 把呈对数生长期的SW480 细胞分为4 组：（1）Control：单加转染试剂组；（2）Negative Control：转染阴性对照RNA 组；（3）OligoB1：转染单链反义寡核苷酸OligoB1 组；（4）OligoB2：转染单链反义寡核苷酸OligoB2 组。然后取转染前、转染12、24、36、48 和60 h 六个时间点加入MTT，测定吸光度反映细胞活力。如图4所示，OligoB1 和OligoB2 细胞组增殖能力逐渐下降，明显低于对照组。

图4 MTT 检测显示抑制CLDND1 基因表达会降低细胞增殖能力Fig.4 MTT assay showed that inhibition of CLDND1 gene decreased cell proliferation

2.6 细胞流式技术显示CLDND1 表达降低能促进细胞凋亡 细胞分为4 组：1.Control 单加了转染试剂组；2.Negative control 转染阴性对照RNA 组；3.OligoB1 转染反义寡核苷酸OligoB1 组；4.OligoB2转染反义寡核苷酸OligoB2 组。如图5所示：图中四个象限分别为UL：死亡细胞；UR：晚期凋亡细胞；LL：活细胞；LR：早期凋亡细胞。比较4 组凋亡率，统计结果显示差异有统计学意义（F=434.878，P＜0.001），以Control 组为基准多重比较结果显示，NC 组与C 差异无统计学意义（P=0.830），B1组、B2 组与C 组差异均有统计学意义（P均＜0.001）。见图5。

图5 流式细胞技术检测CLDND1 基因表达降低后细胞凋亡情况Fig.5 Cell apoptosis was detected by flow cytometry after reduced expression of CLDND1 gene

3 讨论

CRC 通常由良性肿瘤即管状腺瘤或锯齿状息肉进展而来，所以它也是最可能预防的癌症。息肉-结直肠癌恶变过程牵涉许多相关因素，CRC 发生的基本特征是基因或表观遗传的不稳定［10］。新近研究表明，LncRNAs 的异常表达与CRC 的发生、发展、侵袭及转移等过程密切相关。OKUGAWA等［11］研究结果显示lncRNA 基于CCAT1 的特异核酸肽信标可以辅助CRC 的诊断和判断手术指征。有科学家利用生物信息学方法结合内源竞争RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）假说推演了结直肠癌中特异性lncRNA⁃miRNA⁃mRNA 的表达模式，并构建了一个lncRNA 相关的ceRNA 网络，从而肯定了lncRNA 在结直肠癌发病分子机制中的重要地位［12］。

本文通过qRT⁃PCR 在收集的结直肠病例标本中检测到CLDND1 在癌组织中的RNA 表达水平明显高于相应癌旁组织，预示其可能可以作为诊断CRC 的分子标志物。利用重组质粒上调SW480 细胞中CLDND1 的转录水平，结果显示，SW480 细胞活力明显高于对照组（图2）。利用RNA 干扰技术下调CLDND1 在细胞中的RNA 水平后，SW480 细胞的增殖能力明显低于对照组，这种现象在干扰24 h 后效果显著（图3）。经检测，CLDND1 转录被明显下调后，SW480 被诱导发生凋亡（图4）。细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，CLDND1 具体在哪一种信号通路中参与了细胞凋亡过程的调控也将是我们下一步工作的研究重点。另外，实验中设计的针对CLDND1 的两条反义RNA 能有效干扰结肠癌细胞SW480 中CLDND1 转录水平的表达，并诱导SW480 细胞发生凋亡。这些结果显示通过下调CLDND1 的转录可能是CRC 治疗的一种基因治疗方法。

本文首次描述了CLDND1 RNA 与CRC 发生发展之间存在密切的相关性，为进一步探讨CLDND1 RNA 对CRC 的影响及CRC 诊断标志物的寻找乃至新治疗靶点的研究提供了理论依据。