李臻 潘教文 王庆国 刘炜

摘要：本课题组在对水稻病害的研究中，鉴定并克隆到一个羧酸酯酶基因 OsCDAP 。为进一步研究该酯酶生物学功能，构建了 OsCDAP 植物过表达载体，通过农杆菌介导的方法转化水稻“中花11”。转基因水稻表型分析显示，过表达转基因水稻植株株高略高于对照，其第一节间长度明显长于对照，而第五节间长度明显短于对照，其他节间长度差异不明显; OsCDAP 过表达株系的剑叶夹角明显大于对照。进一步对转基因水稻GA和BR合成及信号转导相关基因进行分析，发现部分基因的表达发生改变。本试验结果显示 OsCDAP 可通过调控内源GA和BR的含量及参与相关信号途径调控水稻节间长度及叶夹角大小，进而对水稻的生長发育产生影响。

关键词：水稻;羧酸酯酶OsCDAP;株高;节间长度;剑叶夹角;赤霉素;油菜素内酯;基因表达

中图分类号：S511.03  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2019）01-0008-06

Biological Function Analysis of Carboxylesterase OsCDAP in Rice

Li Zhen Pan Jiaowen Wang Qingguo Liu Wei

（1. Biotechnology Research Center/Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，

Ecology and Physiology， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014，China）

Abstract Our research group cloned and indentified a carboxylesterase gene OsCDAP in the study of rice diseases. In order to study its function， an over-expression vector containing OsCDAP was constructed， and the transgenic lines of rice Zhonghua 11 were harvested through Agrobacterium-mediated transformation. Phenotype analysis showed that the plant height of OsCDAP over-expressed rice was slightly higher than that of control. The length of the first internode of transgenic strains was significantly longer than that of control， while the length in the of the fifth internode was significantly shorter than that of the control. There were almost no significant differences in the other internode length between transgenic strains and control. The leaf angles of flag leaves of transgenic strains were significantly larger than those of control. The expressions of GA and BR synthesis and signal transduction genes were also changed corresponding to the phenotypes variation. The results indicated that OsCDAP might regulate rice internode length and leaf angle by regulating the GA and BR synthesis and participating in signal transduction， which eventually lead to the variation of growth and development of rice.

Keywords Rice; Carboxylesterase OsCDAP; Plant height; Internode length; Flag leaf angle; GA; BR; Gene expression

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米作为主食。随着全球人口的增加和耕地面积的减少，选育优质高产的水稻品种对于维系世界粮食安全具有重要意义。株高及叶夹角是水稻株型形成的关键因素，与产量密切相关[1，2]。研究发现，水稻体内多种基因参与株高及叶夹角的调控过程。其中生长素（auxin， IAA）、赤霉素（gibberellin， GA）以及油菜素内酯（brassinolide，BR）在调控株高及叶夹角形成过程中均发挥重要作用。半矮秆基因SD1的发现带来第一次绿色革命，该基因编码GA合成途径关键酶GA20ox-2氧化酶基因，该位点的突变可以导致水稻不同程度的矮化[3];其他参与GA合成的基因如水稻贝壳杉烯氧化酶基因OsKO2[4]、GA氧化酶基因GA20ox1[5]以及GA3β羟基化酶基因OsGA3ox2[6]的缺失突变，均可导致水稻植株矮化。而BR合成基因D2、D11以及OsBR6ox等基因的缺失，不但导致突变体水稻株高降低，还能导致叶夹角变小[7-9]。SMOS1和DLT是BR、IAA和GA互作的关键基因，其功能缺失导致植株出现矮化、节间变短、叶片直立等表型[10，11]。

羧酸酯酶是一大类水解酶家族，参与多种生物学过程，在植物生长发育、植物与病原物的互作、除草剂等植物毒素的代谢、植物激素信号物质的活化以及植物响应胁迫等过程发挥重要作用[12-15]。课题组前期在水稻中克隆到一个羧酸酯酶基因 OsCDAP （LOC_Os11g04350），该基因在水稻茎中高表达，并受GA诱导，GA抑制剂PAC可抑制其表达[16]。本研究通过构建 OsCDAP 过表达载体，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，再经多代筛选和鉴定，获得过表达 OsCDAP 的转基因株系，并对其表型进行分析，以期更好地解析羧酸酯酶在植物中的功能及为水稻育种研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物材料：水稻“中花11”种子由本实验室保存。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α感受态购自Transgen公司（济南雨同生物科技有限公司）;农杆菌菌种LBA4404及含有目的基因的克隆载体pMD18-T-CDAP由本实验室保存;植物双元表达载体p1301- bar -UBI由山東农业大学温孚江教授惠赠，该载体是以pCAMBIA1301为骨架改造而成，含有除草剂Basta筛选基因和单子叶植物Ubiqutin启动子。

主要试剂：限制性内切酶、T4 DNA ligase 以及RNA反转录试剂盒PrimeScript  TM  1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 均购自TaKaRa公司（大连宝生物）;植物RNA提取试剂盒TransZol Plant （Code： ET101-01） 以及高保真 Taq  DNA Polymerase购自Transgen 公司;质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司;荧光定量PCR所用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Code：13135900）试剂购自罗氏公司;除草剂PPT购自Sigma公司;除草剂Basta（有效成分PPT=18%）购自日本农药株式会社;所用引物均由上海英潍捷基公司合成;其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 植物表达载体的构建及水稻的遗传转化

用 Pst  I和 Bam H I分别双酶切含有目的基因的克隆载体pMD18-T-CDAP以及植物双元表达载体p1301- bar -UBI，切胶回收目的基因片段和线性化的植物表达载体，经T4 ligase连接，将酶切鉴定正确的阳性重组质粒命名为p1301- bar - OsCDAP 。构建成功的植物双元表达载体用热激法转入农杆菌菌株LBA4404中，侵染水稻愈伤组织，用10 mg/L的PPT进行3次抗性筛选，经诱导及分化获得转基因组培苗。

将培养基上的转基因苗移栽至土中，待生长至6叶期，用浓度0.2%Basta溶液涂抹叶片进行抗性筛选。筛选出的阳性苗，提取叶片DNA，利用基因上游引物OsCDAPF（5′-GCCAAGATAGCAAGAGAGTCC-3′）与植物表达载体上的Nos（5′- CCCGATCTAGTAACATAGAT-3′）下游引物组合检测过表达转基因阳性植株，并经多代筛选获得纯合株系。

1.3 RNA的提取及反转录

按照TransZol Plant 试剂盒说明书提取水稻组织总RNA，并参照TaKaRa PrimeScript  TM  1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将检测合格的RNA反转录合成第一链cDNA。

1.4 实时荧光定量PCR

根据GA及BR合成及信号转导相关基因全长序列设计实时荧光定量PCR引物，所用基因名称及引物序列见表1。反应在ABI PRISM 7900 HT（Applied Biosystems）荧光定量PCR仪上进行，反应体系为20 μL，方法参照FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）说明书。反应条件：95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环。按照2  -ΔΔCT 法计算基因的相对表达量。

1.5 转基因株系表型分析

成熟期水稻株高：以生长到抽穗期结束的水稻为材料，测定茎基部至穗顶部的长度;成熟期水稻节间：以每株水稻主要分蘖为材料，从第一节开始测定每节长度，一共测量5节;成熟期水稻穗长：以每株水稻主要分蘖为材料，测定从穗部节到穗顶部的长度;成熟期水稻剑叶夹角：以生长到抽穗期结束的水稻为材料，利用量角器测定剑叶与主茎之间的角度，每株系测量20株。

1.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2007进行数据整理并作图，利用SPSS 23.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 转基因株系的获得

转基因组培苗经继代、Basta抗性筛选及PCR鉴定，最终获得过表达转基因株系7个。通过荧光定量PCR检测转基因株系中基因的表达量，结果显示，转基因株系中 OsCDAP 基因的表达量明显上升，表明 OsCDAP 基因成功转入水稻植株（图1）。根据各株系中基因表达量的差异，选取OE1、OE3和OE5三个株系，分别命名为OECDAP1、OECDAP2和OECDAP3，其基因表达量分别为对照的78.24倍、128.41倍和407.38倍，以这三个株系为基础开展下一步研究。

2.2   OsCDAP 转基因株系表型分析

对OECDAP1、OECDAP2、OECDAP3各株系进行株高、节间长度、穗长以及剑叶夹角统计，结果显示，转基因水稻的株高和穗长与对照相比没有显著差异。过表达水稻植株的第一节间长度与对照植株相比差异显著，OECDAP1、OECDAP2、OECDAP3第一节间长度分别为43.04、41.42、41.56 cm，各为对照的1.10、1.06、1.07倍;而各转基因株系第五节间长度均短于对照，且过表达转基因株系OECDAP1、OECDAP2的长度与对照相比差异显著，分别为2.04 cm和2.19 cm，其他节间长度差异不明显（图2，图3）。各过表达株系的剑叶夹角均显著大于对照，对照植株的剑叶夹角大部分处于30°到60°之间，最大角度不会超过100°，而各转基因株系剑叶夹角大部分处于120°到150°之间，最小角度在100°左右（图4）。

2.3   OsCDAP 过表达转基因株系中GA及BR相关基因的表达分析

鉴于GA和BR在节间伸长和叶夹角调控中发挥重要作用，因此检测了各转基因水稻株系中参与GA及BR合成及信号转导关键基因的表达变化，发现：各转基因株系中GA合成相关基因OsGA3ox-2、OsGA2ox-3、OsGA20ox-1、OsGA20ox-3的表达与对照相比变化均不明显，但OsGA20ox-2和SLR1在各转基因株系中表达均上调（图5）。OsGA20ox-2表达量上调最高为对照3.89倍，SLR1表达量上调最高为对照2倍。BR合成相关基因D2、D11表达下调，而OsBR6ox表达明显上调，表达量最高为对照5倍;BR信号转导相关基因表达上调，其中OsBAK1表达上调明显，最高为对照 5.74 倍（图6）。

3 讨论与结论

节间是水稻生活力最旺盛的部位，节间数目与着生在节基部的叶片数目对应，一般有十几个不等，但只有地面以上的4～5个节间才是株高的主要构成部分。课题组前期研究显示 OsCDAP 在水稻茎中表达量明显高于其他组织，显示该基因可能参与水稻茎秆的伸长[16]。对成熟期水稻株高、穗长及节间长度进行测量发现，该基因的过表达转基因株系整体株高及穗长都略高于或长于对照，但是差异不显著;过表达水稻株系的第一节间长度明显长于对照，而第五节间长度明显短于对照，其他节间长度差异不明显。推测该基因参与水稻节间发育过程，水稻中节间伸长过程受到多个基因的协同调控，许多编码GA生物合成和信号转导途径相关的基因都与水稻节间伸长密切相关[17]，如水稻GA13氧化酶基因CYP714B1和CYP714B2，能够降低内源GA的生物活性，这两个基因的双突变体倒一节间相比于对照更长;EUI1基因参与GA合成的反馈调控，该基因的缺失突变体可导致水稻顶部节间异常伸长[18，19]。利用荧光定量对GA合成及信号转导相关基因的表达进行测定发现，GA合成关键基因OsGA20ox-2和信号转导关键基因SLR1表达上调。研究发现，OsGA20ox-2能够催化GA53转化成GA20，该基因的突变能够导致植株中GA53的积累，GA20和有活性的GA1含量降低，从而产生水稻半矮秆表型[20]。在本研究中，过表达转基因株系中OsGA20ox-2的表達上调能够提高活性GA1的积累，从而促进茎秆伸长。SLR1编码一个DELLA蛋白，是GA信号传导的负调控因子，也能整合并放大水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）介导的防卫信号，在调控水稻生长和先天免疫反应中发挥多重作用[21]。研究表明GA的信号传导受SLR蛋白出现和消失的控制，即GA达到一定浓度时，SLR蛋白消失，GA的信号得以传导下去，但GA反过来刺激SLR的转录和翻译，从而抑制GA的传导[22]。推测过表达 OsCDAP 基因能够调节活性GA1含量增加从而刺激 SLR 的转录，使转基因株系中 SLR 基因表达量升高。对 OsCDAP 基因是否通过调控水稻内源GA活性，从而调控水稻节间的发育还需要进一步验证。

水稻叶夹角是水稻品种的重要评价指标，与水稻的生产和抗病性息息相关，合适的叶夹角可以使植株具有良好的光捕获能力，提高植株光合作用效率。已知植物激素参与叶夹角的调控，迄今鉴定到调控叶夹角的大多数基因都与BR合成及信号转导途径有关。例如：水稻BR合成关键基因D2和D11的突变体表型均为：叶夹角明显减小，叶片直立，茎秆短而粗，上部第2节间明显比野生型短甚至不伸长[7，8]。在本研究中D2和D11这两个基因表达均下调，但是转基因株系叶夹角反而变大，与D2和D11缺失突变体表型相反，进一步分析发现另外一个BR合成的关键基因OsBR6ox表达明显上调，推测由于该基因的上调回补了D2和D11的下调表型，导致叶夹角变大。另外BR信号转导相关基因OsBAK1表达明显上调，OsBAK1是OsBRI1的共受体，研究表明OsBAK1的表达会改变水稻多个重要农艺性状，如：株高、叶夹角、粒型和抗病性[23]。通过抑制OsBAK1的表达，可以在不影响生殖生长的情况下获得直立叶的表型，OsCDAP基因是否通过调控该基因的表达从而调控叶夹角的大小，还需要进一步验证。

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