张玉霞 袁小远 王友令 孟凯

摘要：为了验证miRNA-2127与p53基因的靶向关系，利用生物信息学软件预测p53与miRNA-2127的结合位点，全基因合成法合成该结合位点的野生型与突变型模板，并将其克隆到pmiR-RB-REPORT  TM 双荧光素酶报告载体中，构建野生型与突变型重组双荧光素酶报告质粒。将293T细胞分为4组，分别共转染野生型报告质粒+阴性对照（NC）、野生型报告质粒+miRNA-2127、突变型报告质粒+NC、突变型报告质粒+miRNA-2127。检测各组细胞中荧光素酶活性差异，结果显示：共转染了野生型报告质粒+miRNA-2127的293T细胞与共转染了野生型报告质粒+NC组相比，荧光素酶活性显著降低（P<0.05）;且突变型报告质 粒+ miRNA-2127组的相对荧光素酶活性显著高于野生型报告质 粒+  miRNA- 2127（P<0.05），说明 miRNA- 2127能够靶向调控p53基因，且结合位点位于3′UTR区369—375间。

关键词：p53;miRNA-2127;双荧光素酶报告系统

中图分类号：S813.10  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2019）01-0001-04

Construction of Dual-Luciferase Reporter

Plasmids by  3′UTR Region of p53 Gene and

Their Targeted Relationship with miRNA-2127

Zhang Yuxia， Yuan Xiaoyuan， Wang Youling， Meng Kai

（Institute of Poultry Sciences， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250023， China）

Abstract To verify the targeted relationship between miRNA-2127 and p53， the binding sites of p53 and miRNAs-2127 were predicted by bioinformatics software. The wild-type and mutant templates of the binding sites were synthesized by the whole gene synthesis method， and were cloned into pmiR-RB-REPORT  TM  dual-luciferase reporter vector to construct the wild-type and mutant-type recombinant dual-luciferase reporter plasmids. The cultured monolayer 293T cells were divided into 4 groups including co-transfected wild-type reporter plasmid + NC control， co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127，  co- transfected mutant reporter plasmid + NC control and co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127， respectively. The difference of luciferase activity in each group was detected. The results showed that compared with co-transfected wild-type plasmid + NC control， the relative luciferase activity of 293T cells in the group with co-transfected wild-type plasmid + miRNA-2127 showed a significant decrease （P<0.05）， and that of co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127 group was significantly higher than co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127 group. The results indicated that miRNA-2127 could targeted regulate p53 and the binding sites were located between 369 and 375 in the 3′ UTR region.

Keywords p53; miRNA-2127; Dual-luciferase reporter system

p53蛋白是一種细胞核磷酸蛋白，能调控细胞生长与基因转录，被认为是一种在许多细胞进程中起到关键调控作用的因子。近年来的研究发现，p53蛋白除了具有肿瘤抑制功能外，其在机体抗病毒免疫反应中也起着重要作用[1]。微小RNA（miRNA）是一类非编码小RNA分子，长度约19～25 nt，普遍存在于真核细胞内，在进化过程中高度保守，其在细胞增殖、凋亡、应激应答及新陈代谢等多项生理过程中发挥重要作用。研究表明，miRNA调控着p53基因的表达[2]。Le等[3]将斑马鱼脑组织中的miR-125b敲除以后发现p53蛋白水平明显上调，miR-125b是p53的负调控因子，miR-125b通过直接作用于p53的3′UTR区在转录水平上调控p53的表达，并诱导细胞凋亡过程。之后，又有研究陆续证实miR-1285、miR-125a、miR-33和miR-504[4]均可直接作用于p53的3′UTR 区，从而在转录水平上负调控p53蛋白的表达。

本研究通过生物学信息方法预测p53基因与miRNA-2127的靶向关系，并试图通过双荧光素酶报告试验来验证二者的靶向关系，以为后续研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

pmiR-RB-REPORT  TM 雙荧光素酶报告载体及检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司;人肾上皮细胞293T细胞系购自ATCC公司;DH5α感受态本实验室保存。DMEM高糖培养基、OPTI-MEM培养基、胎牛血清均为Gibico产品;Lipofectamine  TM  3000为天根品牌。

TIAN prep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒、Universal DNA Purification Kit DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司;限制性内切酶（XhoⅠ、NotⅠ）、DNA聚合酶、普通DNA聚合酶购自Thermo公司;蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品;氨苄青霉素为Sigma产品。

1.2 miRNA-2127与p53基因靶向关系的生物信息学预测

参考miRNA数据库（http：//www.mirbase.org）利用生物信息学方法（TargetScan、PicTar、miRanda）分析预测p53与miRNA-2127的靶向关系。

1.3 p53基因3′UTR序列扩增与合成

经生物信息学预测，miRNA-2127与p53基因3′UTR区结合，通过全基因合成方法合成p53 3′UTR区全基因模板（即野生型），然后通过改变miRNA-2127与3′UTR结合位点（369—375）的氨基酸序列使miRNA-2127不能与p53的3′UTR区结合（即突变型）。野生型与突变型均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 双荧光素酶报告载体构建及转化

用XhoⅠ、NotⅠ分别对p53野生型与突变型基因模板以及pmiR-RB-REPORT  TM 载体进行双酶切。酶切反应体系如下：10×H缓冲液4 μL，DNA约2 μg，内切酶（10 U/μL）各1 μL，灭菌去离子水补足到40 μL，置37℃作用4 h。酶切后按照纯化试剂盒说明书进行纯化回收。

取回收的目的片段DNA 2 μL（约150 ng），载体0.5 μL（约50 ng），solution I快速连接液5 μL， 灭菌去离子水补足到10 μL，16℃连接30 min。取连接产物加到100 μL DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30 min。将上述转化液置于42℃水浴90 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min。向其中加入900 μL 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150 r/min、37℃振荡培养45 min。2 500 r/min离心5 min，弃上清，留100 μL混匀菌液，置于含Amp抗生素的LB固体琼脂培养基上37℃培养12～16 h。

1.5 PCR鉴定及测序

挑取上述平板上的单菌落，溶入3 μL水中，取0.5 μL做模板，进行PCR鉴定。采用10 μL反应体系：10×Taq buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 5 μL，载体上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶 （2.5  U/μL）0.3 μL，DNA模板0.5 μL（约100 ng），用灭菌水补足10 μL体系。反应条件为：95℃预变性3 min;循环内95℃变性30 s，56℃退火，72℃延伸1 min，20个循环;PCR反应循环后72℃继续延伸3 min。结束后，取5 μL PCR产物进行 1.5% 琼脂糖电泳分析。

回收PCR产物，将其连接至pGEM-T Easy Vector载体中，转化至感受态DH5α，均匀涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板中常规培养。16 h作用挑取白色菌落扩增培养，提取质粒进行PCR鉴定，将鉴定合格菌液送华大基因公司一代测序法测序。

1.6 细胞培养及转染

取对数生长期的293T细胞，以每孔1.5×10 4个细胞接种于96孔板中，每孔总体积100 μL，于37℃培养箱中培养18 h。选用对数生长期细胞，试验共分4组：A组为共转染阴性对照 （non- target control，NC）和野生型报告质粒组;B组为共转染miR-2127和野生型报告质粒组;C组为共转染阴性对照与突变型报告质粒组;D组为共转染miR-2127与突变型报告质粒组。取2 μL OPTI-MEM培养基稀释miR-2127或阴性对照NC，3 μL OPTI-MEM培养基稀释靶基因野生型或突变型报告质粒，5 μL OPTI-MEM培养基稀释0.225 μL Lipofectamine  TM  3000试剂，三者混合，共10 μL，轻轻摇匀，静置15 min。将培养板内的细胞液吸弃，每孔加入90 μL完全培养基，然后加入上述混合液10 μL，最终每孔总体积100 μL。其中miR-2127转染浓度均为50 nmol/L，质粒浓度为100 ng/孔，每组设3个复孔。于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养。

1.7 各组荧光素酶活性检测

转染48 h后吸出培养基，以35 μL/孔加入PBS，并加入luciferase底物35 μL/孔，振荡10 min，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，测定293T细胞中的荧光值。

1.8 统计学处理数据

采用SPSS软件进行单因素方差分析和t检验，比较4组细胞中荧光值的差异。

2 结果与分析

2.1 p53基因野生型及突变型报告质粒的PCR鉴定

随机挑取突变型和野生型菌落，进行菌液PCR鉴定，扩增的条带理论大小为636 bp，其实际扩增条带如图1所示，与预期片段大小一致。

2.2 p53基因野生型及突变型报告质粒测序结果

由图2测序结果可见，已成功将靶序列ACTGAAA （369—375）突变为TGACTTT。

2.3 各组细胞中荧光素酶活性变化

一般条件下，miRNA跟NC对照相比，野生型载体报告荧光有所下调，则认为miRNA对报告基因有调节作用[5]。由图3可见，miRNA-2127+野生型报告质粒组293T细胞中的相对荧光素酶活性较NC+野生型报告质粒组显著降低（P< 0.05）， 证明miRNA-2127能有效抑制野生型质粒荧光素酶的活性;miRNA-2127+突变质粒报告组293T细胞中的相对荧光素酶活性显著高于miRNA- 2127+ 野生型质粒报告组（P<0.05）。证明miRNA-2127质粒无法抑制突变型荧光素酶活性。因此表明miRNA-2127与预测到的p53基因3′UTR位点有明显的相互作用。

3 討论与结论

p53基因是迄今为止已发现与肿瘤发生相关性最高的基因，野生型p53基因通过调控细胞周期内的增殖、分化和凋亡来维持生物机体内基因组和细胞的稳定，可抑制肿瘤生长，而突变型p53基因则能促进肿瘤的发生发展，诱导原位癌的形成，该突变位点可应用于肿瘤的早期诊断[6]。p53蛋白除了作为热门的肿瘤抑制蛋白被大量研究之外，还被发现是宿主天然免疫因子，其对不同种类病毒复制的抑制作用不断被证实。2003年Takaoka等[7]首次报道p53具有抗水泡性口炎病毒的作用，研究还发现p53蛋白能够抑制新城疫病毒[8]、传染性法氏囊病毒[9]、脊髓灰质炎病毒等的复制。2006年，Voorhoeve等[10]在筛选人miRNA时首次发现miRNA参与p53信号通路，是p53信号通路调控网络中的关键分子，miRNA通过特异结合mRNA，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而参与调控细胞的生长与凋亡。因此通过挖掘调控p53的miRNA，可为宿主抗击疾病提供更深层次的解读，也可为开发更广谱的抗肿瘤和病毒的基因药物奠定基础。

构建合适的报告载体，对增加或降低p53蛋白含量的miRNA进行筛选非常重要。本研究经PCR和测序鉴定，证实已成功构建p53基因的双荧光素酶报告表达载体。双荧光素酶报告检测系统显示miRNA-2127+野生型荧光素酶活性较阴性对照+野生型对照明显降低，提示miRNA-2127可直接作用于p53基因的3′UTR区，抑制其荧光素活性。这为进一步研究miRNA提供了基础。

参 考 文 献：

[1]晏文君， 吴开宝， 马志永. 肿瘤抑制因子p53功能及其抗病毒作用研究进展[J]. 病毒学报， 2012，28（4）：462-470.

[2]李宇鹏， 张一鸣， 胡海碧，等. 肝癌细胞HepG2中p53调控miRNA-3661的生物信息分析与功能验证[J]. 生物技术通报， 2017， 33（7）：216-223.

[3]Le M T N， Teh C， Shyh-Chang N， et al. MicroRNA-125b is a novel negative regulator of p53 [J].Genes & Development， 2009， 23（7）： 862-876.

[4]Hermeking H. MicroRNAs in the p53 network： micromanagement of tumour suppression [J].Nature Reviews Cancer， 2012， 12（9）： 613-626.

[5]魏斌， 邓霞， 卞秀娟，等. AKT2 3′-UTR荧光素酶报告基因载体构建及与miRNA-625靶向关系验证[J]. 江苏大学学报（医学版），2016， 26（3）：204-207.

[6]贾春平. 抑癌基因p53与肿瘤研究的最新进展[J]. 生命科学， 2008， 20（3）：450-453.

[7]Takaoka A， Hayakawa S， Yanai H， et al. Integration of interferon-α/β signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence [J]. Nature， 2003， 424（6948）： 516-523.

[8]Fábián Z， Csatary C M， Szeberényi J， et al. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines [J]. Journal of  Virology，2007， 81（6）： 2817-2830.

[9]欧阳伟， 王永山， 王永强，等. 传染性法氏囊病病毒感染细胞内源性microRNA表达差异分析[J]. 中国兽医学报， 2012， 32（3）：329-336.

[10]Voorhoeve P M， le Sage C， Schrier M，et al. A genetic screen implicates miRNA-372 and miR-373 as on cogenes in testicular germ cell tumors[J]. Cell， 2006， 124（6）：1169-1181.