尤梅桂，翁乐斌，吴雅茗

(1.厦门医学院基础医学部，福建 厦门 361023；2.厦门医学院机能与临床转化福建省高校重点实验室，福建 厦门 361023)

肝癌是世界排名第二的最常见肿瘤,因肝癌死亡的患者中中国占超过一半。因此中国作为肝癌高发的国家,对肝癌的诊疗迫在眉睫。熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，是一种较为常用的治疗原发性胆汁性肝硬化的药物[1]。近年来大量的研究发现熊去氧胆酸还具有多样的抗肿瘤活性，如诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞分化等，是一种较好的抗肿瘤候选药物[2-3]。此外，UDCA对正常组织和细胞没有明显的细胞毒作用。因此，本研究旨在探讨UDCA诱导人肝癌细胞BEL-7404凋亡的作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人肝癌细胞BEL-7404来源于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。细胞培养基RPMI1640(杭州四季青生物工程材料有限公司)；小牛血清UDCA(标准品，含量99.99%，每支200 mg，Sigma产品)，阳性对照药氟尿嘧啶(FU,Santa Cruz产品)。抗caspase-9兔抗体、抗survivin兔抗体、抗Bax兔抗体、抗Bcl-2小鼠抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司；抗procaspase-3兔抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；MK3 酶联免疫检测仪(美国Thermo公司)；SW-CJ-1D型医用超净化工作台(苏州净化设备厂)；Olympus CX22生物显微镜(日本Olympus公司)等。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制试验 用适量0.25%胰酶消化处于对数期的人肝癌细胞BEL-7404，加入培养基制成细胞悬液。将细胞加入96孔酶标板中，每孔100 μL，设置3个副孔，置于37 ℃恒温、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养24 h左右。分别加入终浓度是20、6.66、2.22、0.75、0.25、0.08 mmol·L-1的目标化合物UDCA，加入阳性对照药1.0 mmol·L-1FU，100 μL/孔。孵育72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，轻轻晃匀，尽量除去气泡。 孵育2.5 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值(A)，A值越高活细胞数也越多。根据A可计算药物对细胞的生长抑制率。

1.2.2 光镜形态学观察 取对数生长期人肝癌细胞BEL-7404悬液(约含2×105个细胞)，2 mL/孔接种于6孔板中，于接种后24 h分别加入不同浓度的UDCA(终浓度分别0.4、0.8、1.6 mmol·L-1)，每组3个孔，另设一组空白和一组1.0 mmol·L-1的FU作为阳性对照。处理24 h后，置于倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.3 Western blot法检测procaspase-3、9和survivin蛋白、Bax/Bcl-2 取UDCA组，阴性对照组和阳性对照在作用48 h后的细胞，加入蛋白裂解液。离心10 min，将上清转移至离心管中。电泳：配制10% SDS-PAGE胶，上样。80 V浓缩胶，120 V分离胶，2.5～3 h，转膜，封闭。抗体孵育：一抗用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释至工作液浓度，将各条膜置于皿中用PBST清洗3次，10 min/次。用PBST稀释二抗至工作液浓度，1 500 μL/条。按前法封袋。37 ℃恒温摇床反应1 h。反应结束后剪开袋口，弃二抗，PBST清洗3次，10 min/次，PBS清洗10 min。于Odyssey近红外荧光扫描仪扫描。

1.3 统计学处理和分析 实验重复3次，结果用mean±SD表示。应用SPSS 11.0软件分析，两个样本均数比较采用t检验，多样本均数比较釆用完全随机的单因素(One-ANOVA)方差分析，组间两两比较采用q检验。若P<0.05表示与对照组相比具有差异，P<0.01表示与对照组相比有显著差异，P>0.05，没有统计学意义。

2 结果

2.1 10 h对人肝癌细胞BEL-7404的生长抑制作用呈浓度-效应和时间-效应关系 如图1所示，当采用不同浓度的药物(0.08、0.25、0.75、2.22、6.66、20 mmol·L-1)处理人肝癌细胞BEL-7404细胞24、48、72 h后，IC50分别为(0.83±0.097)、(0.79±0.088)、(0.67±0.071) mmol·L-1，细胞呈不同程度的抑制作用，且这种现象存在一定的药物浓度-效应关系和时间-效应关系。

2.2 光镜观察结果 空白对照组人肝癌细胞BEL-7404生长状态良好，多呈梭形，贴壁生长，轮廓清晰，胞质均匀透明，细胞间结构紧密；随培养时间延长形态基本变化不大。UDCA处理后，细胞的形态、贴壁能力、集落性都有不同程度改变。随着UDCA浓度的增大，细胞膜皱缩，细胞间隙增宽，细胞体积变小，活细胞数目逐渐减少，细胞碎片也逐渐增多，部分细胞脱落、漂浮于培养液中。光镜下观察得出UDCA可以引起BEL-7404细胞凋亡。

2.3 Western blot结果 如图2所示，Bcl-2蛋白表达减少且蛋白水平的变化呈一定的浓度依赖性(P<0.05)，Bax的表达变化不明显(P>0.05)，Bax与Bcl-2蛋白的比率显著增加，说明此时细胞趋向凋亡状态。通过Western blot定量的观察UDCA对procaspase-3和survivin蛋白表达的影响。如图3所示，与空白对照组相比，UDCA细胞在给予(0.4、0.8、1.6 mmol·L-1)后，procaspase-3、survivin蛋白表达减少，提示UDCA可能是通过survivin/smac线粒体信号通路激活caspase-3、survivin的表达。

图1 UDCA不同时间不同剂量下对BEL-7404增殖抑制的比较

图2 UDCA对Bax和Bcl-2蛋白的影响

图3 UDCA对 procaspase-3和survivin蛋白的影响

3 讨论

Bcl-2存在于线粒体外膜，可中和Bax/Bax同源二聚体所诱导的凋亡作用。Bax作用于线粒体外膜形成孔道，改变胞膜的通透性，触凋亡。决定细胞凋亡与否的关键是二者的比率，所以也将Bax和Bcl-2的比值称为“凋亡开关”[4]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。研究表明[5-6]survivin广泛高表达于HepG2、Huh7和SK-Hep1等肝癌细胞系及人肝癌组织，与肝癌细胞凋亡调控密切相关。由于survivin蛋白主要作用机制是抑制凋亡蛋白caspase-3的表达，从而降低了细胞对凋亡的抵抗性，抑制细胞凋亡。

研究发现可以UDCA通过多途径作用于肝癌细胞抑制肝癌细胞迁移和增殖。近UDCA抗癌的主要机制有：①升高促凋亡因子Bax，降低抗凋亡因子Bcl-2而诱导凋亡线粒体通路发挥抗肝癌细胞的作用[7]；②抑制凋亡抑制蛋白survivin的表达，增加caspase-3含量，从而诱导肝癌细胞凋亡[8-9]；③抑制JAK-STAT3-COX-2，拮抗IL-6诱导的肝癌细胞的增殖[10-11]。研究表明UDCA抗癌作用机制还可能与细胞增殖周期有关。

本研究结果显示UDCA能抑制BEL-7404增殖，诱导细胞凋亡，并呈浓度、时间依赖性。CCK-8实验结果显示 UDCA对BEL-7404细胞增殖有明显的抑制作用，并且随UDCA浓度越高，对细胞增殖的抑制作用越强。作用的时间越久，对细胞增殖的抑制作用也越强。通过光镜观察，UDCA 可诱导BEL-7404细胞出现典型的凋亡形态学改变。Western blot结果表明，UDCA可诱导Bcl-2蛋白表达下降，procaspase-3和survivin蛋白表达下降。该结果提示UDCA通过诱导Bax/Bcl-2水平升高，survivin蛋白表达下降，诱导BEL-7404细胞凋亡。

综上所述，UDAC能够抑制BEL-7404细胞增殖和诱导其凋亡，有望成为治疗肝癌的候选药物之一，其作用机制可能与激活procaspase-3引起Bax/Bcl-2表达上调，同时使得survivin蛋白表达下降，减低细胞对凋亡的抵抗性有关。