张夏 姚尚辰 胡昌勤

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

丙酸交沙霉素(图1)是交沙霉素9位丙酰化产物，属于半合成大环内酯类抗生素，临床上广泛用于治疗化脓性链球菌引起的各类感染，也可用于对青霉素、红霉素耐药的葡萄球菌感染。由于交沙霉素发酵过程中可能引入多种小组分，其本身含有多个衍生化位点，衍生化过程中还可能产生多种的衍生化产物等[1]，因此丙酸交沙霉素组分/杂质的种类复杂，各组分/杂质的含量差异较大，增加了其有关物质合理控制的难度。按大环内酯类抗生素的控制理念，开发具有高专属性的HPLC方法，保证分析方法具有理想的重复性和粗放性，方便地实现对样本中诸组分/杂质的快速定位，仍是方法学研究的关键[2]。

本文采用试验设计(design of experiment, DoE)的理念建立丙酸交沙霉素HPLC有关物质分析方法。与传统的 “试错法(trial and error)”或者“单因素变化法(one factor at a time)”相比较，试验设计方法应用数理统计学的原理，通过合理地安排试验、获取数据、对结果进行综合分析，从而实现对影响分离的诸关键因素(强溶剂保留、流动相pH、柱温等)与溶质保留值、分离度的关系等的充分认知[3]，因此特别适用于对复杂组成的大环内酯类抗生素有关物质分析方法的建立与优化。

1 实验部分

1.1 试药

丙酸交沙霉素原料(来源：日本安斯泰来制药公司，批号：PJTYB036、PJTYB037、PJTYC001)；丙酸交沙霉素标准品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：130361-200301，含量：85.3%)。

醋酸铵(国药集团化学试剂有限公司，化学纯，批号：F20100910)，乙腈为色谱纯，重蒸水。

1.2 仪器

戴安U3000型液相色谱系统(Thermo Fisher Scienti fi c公司，Waltham，MA)。

1.3 方法

图1 丙酸交沙霉素的结构式Fig.1 The structure of josamycin propionate

用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以0.015mol/L醋酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱。流速为1.0mL/min，检测波长为231nm；柱温为40℃。取丙酸交沙霉素标准品适量，加乙腈溶解并稀释制成约含1mg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。取20μL注入液相色谱仪。

表1 梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution program

1.4 软件

试验设计软件为Design Expert(试用版，Stat-Ease公司，Minneapolis，MN)。

2 结果与讨论

2.1 已有方法的比较

采用各国药典及文献丙酸交沙霉素有关物质分析方法(表2～3)分析丙酸交沙霉素样品，各国药典方法的色谱图见图2，文献方法的色谱图见图3。从主成分的峰形看，日本药局方方法及文献方法略好，但全部方法的分离度均不理想；中国药典方法有严重的共流峰现象；且实验时发现柱压缓慢升高，可能与流动相中有机相比例过高[磷酸盐缓冲液-甲醇(18:82, V/V)]有关。

对比各色谱统分离条件与分析结果可见，采用C18色谱柱、醋酸盐和乙腈为流动相有利于各成分的分离，但无法通过简单的试错法等得到理想的分析结果。因此采用DoE方法，以15mmol醋酸铵溶液-乙腈(30:70)为流动相、柱温40℃、流速1mL/min作为初始条件进行优化。

2.2 DoE设计参数的选择

DoE设计需要首先明确自变量与因变量。通过初步试验，对影响丙酸交沙霉素分离结果关键色谱参数与指标进行筛选，选择对丙酸交沙霉素分离有显著影响的色谱参数为自变量，对直接与分离结果相关的指标如难分离物质的分离度、色谱峰个数等为因变量，进行DoE优化。

按初始分析条件，选择10支不同品牌的色谱柱分析丙酸交沙霉素，结果显示，Xtimate C18(250mm×4.6mm, 5μm, Acchrom)的总体分离情况最好，以此作为DoE优化实验中的色谱柱。

表2 丙酸交沙霉素各国家标准中的有关物质方法对比Tab.2 Comparison of related substance methods in different national pharmacopoeias

表3 丙酸交沙霉素文献方法对比Tab.3 Comparison of related substance methods in different literatures

筛选流动相中影响分离的关键因素。按初始分析条件，保持洗脱强度不变，改变有机相类型。以流动相15mmol醋酸铵溶液-甲醇(35:65, V/V)、15mmol醋酸铵溶液-四氢呋喃(35:65, V/V)分析丙酸交沙霉素样品，发现色谱峰峰形不佳，主峰前部抬高，且杂质分离较差，说明甲醇和四氢呋喃不适合丙酸交沙霉素杂质分离。改变流动相中乙腈的比例，采用流动相15mmol醋酸铵溶液-乙腈(35:65,V/V)、(30:70, V/V)、(25:75, V/V)分析丙酸交沙霉素样品，结果显示乙腈比例对杂质分离的情况影响较大。改变醋酸铵溶液的浓度，分别以3、15和100mmol醋酸铵溶液分析丙酸交沙霉素样品，结果显示缓冲盐浓度对杂质分离情况影响较大。分别改变流动相醋酸铵溶液的pH值(15mmol醋酸铵溶液的pH约为6.8)为pH5.0和pH8.0，分析丙酸交沙霉素样品，结果显示，pH5.0时峰形前延，而pH8.0时对分离影响不大，提示，DoE优化中醋酸铵溶液的pH值可不作为重要因素进行优化。

图2 丙酸交沙霉素有关物质各国药典方法色谱图Fig.2 The typical chromatograms of related substance methods in different national pharmacopoeias

图3 丙酸交沙霉素文献方法色谱图Fig.3 The typical chromatograms of related substance methods in different literatures

进一步确定其它色谱参数的影响。以柱温30、40和50℃分析丙酸交沙霉素样品，结果显示，柱温对杂质分离情况影响较大。而改变流速，以流速0.8、1.0和1.2mL/min分析丙酸交沙霉素样品，结果显示流速对分离的影响不大。

基于以上试验，确定DoE设计中，选择流动相中的有机相比例、缓冲盐浓度和柱温作为优化中的自变量，主峰和主峰前色谱峰的分离度(Rs)、第一区间杂质个数(Nimp1)、第二区间杂质个数(Nimp2)作为优化中的因变量。

2.3 DoE优化

采用响应曲面设计(RSM)。运用Design Expert软件得到试验运行表，运行试验，得到响应结果(表4)；利用响应值建模，得到各模型参数(表5)；对各模型进行方差分析(表6)，Rs模型的R2偏低，方程回归性稍差；其余模型各参数良好。各模型的回归方程见表7。

表4 丙酸交沙霉素试验运行表及结果Tab.4 The run list and results of each run

扰动图可直观地说明因素对响应结果的影响。图4a显示因素B、C对Rs影响显著，Rs随因素B(缓冲盐浓度)、C(柱温)的增大而减少。图4b显示因素B、C对Nimp1影响显著，Nimp1随因素C增大而增大，随因素B增大而减少。从图4c可以看出，因素A(有机相比例)、B、C对Nimp2影响显著，Nimp2随因素B增大而减少，随因素A、C增大先增大后减少。

建立因素对响应结果的响应面。由于Rs采用线性模型拟合，因此因素间无交互作用(图4d)；因素B、C之间也无交互作用，但因素B具有二阶作用(图4e)；而因素A、B间具有交互作用(图4f)。

表5 丙酸交沙霉素模型参数Tab.5 The model parameters of each response

表6 丙酸交沙霉素方差分析表Tab.6 The analysis of variance table

采用满意度函数法，求解丙酸交沙霉素色谱系统的最优值，根据优化标准(表8)可得到14个解(表9)，满意度响应面见图5。按解1条件分析丙酸交沙霉素，并以预测误差(PE)为指标评价模型的预测性， Rs、Nimp1、Nimp2的PE值的绝对值均小于20，说明模型预测性良好。据此确定了丙酸交沙霉素最优化色谱系统：流动相为15mmol醋酸铵溶液-乙腈(34:66, V/V)、柱温40℃、流速1.0mL/min、色谱柱为Xtimate C18(250mm×4.6mm, 5μm)，色谱图见图6。

表7 丙酸交沙霉素的回归方程Tab.7 The regression equations of each model

图4 丙酸交沙霉素响应结果的扰动图和响应面Fig.4 The perturbation diagram and response surface of each response

表8 丙酸交沙霉素满意度函数法优化标准Tab.8 The optimization standards using desirability function method

表9 满意度函数法得到的丙酸交沙霉素色谱系统最优值Tab.9 The optimal HPLC condition using desirability function method

图5 丙酸交沙霉素色谱系统的满意度响应Fig.5 The desirability surface of the HPLC system

如采用梯度洗脱的方式，流动相A为15mmol醋酸铵溶液，流动相B为乙腈，在0、24、44、50、51和65min时，流动相B的比例为66%、66%、80%、80%、66%和66%，流速为1.0mL/min，柱温40℃，还可适当减少分析时间(图7)。

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度试验

图6 丙酸交沙霉素色谱系统典型色谱图Fig.6 The typical chromatogram of the developed method

图7 丙酸交沙霉素梯度方法色谱图Fig.7 The typical chromatogram of the developed method using gradient elution

将精密度试验溶液连续进样6针，以主成分峰面积计，得到方法的日内精密度为0.23%，以A组分峰面积计，得到方法的日内精密度为0.20%，均小于2.0%，表明本试验方法的精密度良好。

2.4.2 线性试验

分别以浓度对主峰峰面积、A组分峰面积进行回归，丙酸交沙霉素主成分和A组分在0.0004～1.9830mg/mL的浓度范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系(R2均为0.9999)。

2.4.3 检测限与定量限

以噪音的3倍为指标，得到方法的最低检测限为0.59ng；以噪音的10倍为指标，得到方法的最低定量限为1.77ng。以丙酸交沙霉素的最低检测限计，0.005%的杂质能够被检出，满足试验要求。

2.5 实际样品的测定

3批丙酸交沙霉素原料含量和有关物质的测定结果见表10。3批原料的含量和有关物质均符合中国药典、进口注册标准和欧洲药典的限度要求。

表10 丙酸交沙霉素原料含量及有关物质的测定结果Tab.10 The determination results of raw materials

3 结论

针对大环内酯类抗生素杂质谱复杂的特点，基于试验设计理念，采用响应曲面法建立了丙酸交沙霉素有关物质分析方法。得到的最佳色谱条件优于丙酸交沙霉素各国药典及文献的有关物质方法，并对影响分离结果的各因素有了全面的理解。该思路可以为其他大环内酯类抗生素有关物质分析方法的建立和优化提供借鉴。该色谱条件采用挥发性缓冲盐作为流动相，也便于后续对新发现的组分/杂质进行质谱分析。