尚蓉霞，余欣，尤翠翠，何海兵，李娟，武立权

( 1.安徽农业大学农学院，安徽 合肥 230036；2.安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036；3.安徽农业大学生物技术中心，安徽 合肥 230036)

全球气候变暖，极端天气频繁发生[1]，增加了中国长江流域夏季高温热害天气的发生频率，每年7月中下旬和8月上旬是高温热害天气主要集中发生期，而在此时间段里水稻正处于幼穗分化期至抽穗扬花期[2].孕穗期是水稻对水分和温度最敏感的时期[3-5]，此时期高温热害会造成水稻花器发育不全，花粉发育不良，活力下降[3]；此时期缺水会造成穗粒数减少、空秕粒率上升、干物重降低，最终导致产量下降[4].因此，有必要开展水稻孕穗期响应高温、干旱胁迫的生理机制研究.

据报道，水稻孕穗期水分胁迫会使剑叶CAT活性和结实粒下降[6]；超级稻在孕穗期干旱胁迫可诱导渗透调节物质积累和抗氧化酶活性升高[7]；水稻孕穗期高温处理后，叶片光合速率降低，结实率降低，穗粒数和千粒重减少，产量下降[8]；干旱胁迫使孕穗期水稻叶片抗氧化酶活性提高[9-10].综上研究多为干旱或高温单方面胁迫的研究.然而，植物在响应多种逆境胁迫时具有一定的交叉适应性.例如，高、低温预处理可增强玉米的抗旱性[11]；盐、冷和热预处理也可不同程度增强水稻幼苗耐寒性[12]；干旱可诱导黄瓜幼苗对低温的交叉适应性[13]；干旱锻炼可提高水稻的抗寒性[14]；干旱预处理可增强玉米幼苗的耐冷性[15].有关水稻孕穗期干旱、高温交叉抗逆性研究较少.因此，本研究在水稻孕穗期设置正常对照、单一干旱、单一高温以及干旱-交叉胁迫试验，考察孕穗期干旱-高温交叉胁迫对水稻剑叶中渗透调节物质含量、抗氧化酶活性和内源激素含量的变化，以及对穗粒数及结实率的影响，探讨其干旱-高温交叉适应的生理响应机制，以期为水稻节水灌溉和大田高温逆境栽培提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在安徽农业大学生物科技楼人工气候室进行，以籼稻品种‘Nagina 22’(Oryzasativaaus)为试验材料.2017年5月26日，挑选籽粒均匀、饱满的水稻种子，经表面消毒、浸种后置于培养皿中在30 ℃恒温培养箱中催芽；选取发芽均匀一致的种粒于带网格的塑料盆(高30 cm，内径25 cm)中，每盆3株，一共72盆，置于人工气候室培养；盆内盛有国际水稻Hoagland营养液(霍格兰配方，表1)[16]，每3天更换一次营养液；气候室生长条件为昼/夜温度为30 ℃/25 ℃，昼/夜光周期为12 h /12 h，相对湿度为75 %，光照强度为3 000 lx.以叶龄余数法[17]诊断幼穗发育进程，在剑叶叶耳刚露出时开始胁迫处理，此时大多数稻穗进入花粉母细胞减数分裂期[18-19].

表1 Hogland营养液配方

硫酸亚铁和柠檬酸,分别用纯水溶解，溶解以后，混合在一起，用纯水定至500 mL.Ⅰ 每升纯水中加入母液5 mL，Ⅱ 每升纯水中加入母液1 mL，Ⅲ 每升纯水中加入母液2.5 mL.营养液pH一般在3左右，需要用NaOH溶液调至为5.5左右.

Ferrous sulfate and citric acid are respectively dissolved with pure water.After dissolving,mix together and set to 500 ml with pure water.Add 5 ml mother liquor to pure water per liter forⅠ;Add 1 ml mother liquor to pure water per liter for Ⅱ;Add 2.5 ml mother liquor to pure water per liter for Ⅲ.The pH of the nutrient solution is generally about 3,which needs to be adjusted to about 5.5 with NaOH solution.

1.2 试验设计

本试验在人工气候室内进行，各处理除温度和模拟干旱外，其余环境设置均相同.试验设置正常生长(CK)、单一干旱(drought treatment， D)、单一高温(high temperature treatment，H)及干旱-高温交叉(drought-high temperature cross stress，DH)4个处理.其中，(1)正常对照，Hoagland营养液中不添加PEG-6000，昼夜温度为25 ℃ /20 ℃；(2)单一干旱处理，在已有文献[9,43]和前期预备试验基础上，明确了10% PEG-6000可使水稻达到中度(干旱胁迫程度，故本研究确定采用10% PEG-6000 Hoagland浇灌模拟中度干旱胁迫，每处理重复 3次，每重复12盆，培养3 d；(3) 单一高温处理，除人工气候室昼夜温度变为38 ℃/30 ℃外，其它条件不变[8]，高温连续处理3 d ，每处理重复 3次，每重复 6盆.(4)干旱-高温交叉处理，取经干旱处理 3 d的水稻植株，重新以Hoagland营养液培养使其恢复供水，待恢复正常后转入高温( 38 ℃ /30 ℃ )处理 3 d，每处理重复 3次，每重复 6盆.

1.3 取样与指标测定

胁迫结束后，各处理随机各选3盆用来取样，取剑叶与稻穗(取全长的一半，留中间部分)用液氮速冻，并置于 -80 ℃冰箱保存备用.余下的植株让其正常生长至成熟.成熟期考种，因处理主要在减数分裂期，对颖花退化和籽粒结实具有显著的影响，因此通过成熟期穗数和结实率等表型指标评估胁迫处理对水稻农艺特征的影响.取上述各处理样品进行如下生理指标测定.

参照李合生[20]和王学奎[21]的方法，分别采用蒽酮比色法、考马斯亮蓝法和硫代巴比妥酸法测定可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量；用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，用愈创木酚法测过氧化物酶(POD)活性，用紫外吸收法测过氧化氢酶(CAT)活性.

脯氨酸(Pro)含量用磺基水杨酸法浸提，采用日本日立公司(Hitach)的全自动氨基酸分析仪(L-8900)分离测定.浸提方法如下：准确称取稻穗0.5 g，液氮研磨，转移到5 mL的离心管中，加入2.5 mL的4%的磺基水杨酸，超声30 min，取1.5 mL上清液于2 mL离心管中，再用超高速离心机以室温、12 000 r/min 的转速离心30 min，用1 mL注射器取上清液过0.22 μm的微孔水系膜于进样瓶中，上机.

植物内源激素玉米素(ZR)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)采用经改良的王艳红[22]和张玉琼[23]的高效液相色谱法分离测定.

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0软件进行数据处理和方差分析，并应用Duncan检验法进行多重比较，检测处理间差异显著性(α=0.05).

2 结果与分析

2.1 干旱-高温交叉逆境对水稻剑叶渗透调节物质含量的影响

由表2可知，单一高温和干旱胁迫下，孕穗期水稻剑叶中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均显著高于CK(P<0.05)，其中，可溶性糖含量分别是CK的0.43和0.52倍，可溶性蛋白含量分别是CK的0.62和0.73倍，脯氨酸含量分别是CK的0.42和0.77倍.干旱-高温交叉处理下孕穗期水稻剑叶中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量进一步地上升，且均显著高于单一高温和干旱胁迫和CK(P<0.05)，其中，可溶性糖含量是CK的1.21倍，可溶性蛋白含量是CK的1.15倍，脯氨酸含量分别是CK的1.84倍.说明，水稻孕穗期适度的干旱预处理有利于增强水稻的渗透调节能力，从而提高其应对高温的能力.

表2 不同胁迫处理下水稻剑叶可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的变化

不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05).

Different normal letters show significant differences between treatments at 0.05 level.

2.2 干旱-高温交叉逆境对水稻剑叶抗氧化酶活性的影响

由表3可知，单一高温和干旱胁迫下，孕穗期水稻剑叶中抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性均显著高于CK(P<0.05)，其中，SOD活性分别比CK提高6.1%和3.6%，POD活性分别比CK提高16.1%和9.4%，CAT活性分别比CK提高13.7%和9.8%.干旱-高温交叉处理下孕穗期水稻剑叶中SOD、POD和CAT的活性进一步提高，且均显著高于单一高温和干旱胁迫和CK(P<0.05)，其中，SOD活性比CK提高10.1%，POD活性分别比CK提高28.6%，CAT活性分别比CK提高22.5%.说明，水稻孕穗期适度的干旱预处理有利于增强水稻清除活性氧的能力，从而提高其应对逆境的抗性.

表3 不同胁迫处理下水稻剑叶中抗氧化酶活性的变化

不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05).

Different normal letters show significant differences between treatments at 0.05 level.

2.3 干旱-高温交叉逆境对水稻剑叶膜脂过氧化的产物MDA含量的影响

单一高温和干旱以及干旱-高温交叉胁迫处理下，孕穗期水稻剑叶MDA含量均高于CK，而干旱-高温交叉处理后MDA的含量较单一高温和干旱处理均显著(P<0.05)下降，下降幅度分别为36.1% 和22.8%(图1).结果表明，水稻孕穗期适度的干旱预处理有利于减轻细胞膜脂过氧化伤害程度.

2.4 干旱-高温交叉逆境对水稻剑叶内源激素水平的影响

表4显示，在单一高温、干旱和干旱-高温交叉3种不同胁迫处理下孕穗期水稻剑叶中IAA、ZA和GA含量较CK均有不同程度的下降，而ABA和SA含量较CK均有显著提高(P<0.05).干旱-高温交叉处理水稻剑叶中IAA、ZA、GA、ABA和SA含量较单一高温和干旱处理又有显著的提高(P<0.05).其中，IAA含量分别提高25.9%和8.6%，ZA含量分别提高4%和31.1%，GA含量分别提高23.5%和17.4%，ABA含量分别提高58.8%和40%，SA含量分别提高34.9%和25.6%.由此可见，水稻孕穗期适度干旱预处理，有利于植物内源激素的调节，尤其是进一步地积累ABA和SA来调节自身的生长，从而提高对高温逆境的抗性.

图1 不同胁迫处理下水稻剑叶MDA含量的变化Figure 1 The change of MDA content in rice leaf under the different stress treatment

表4 干旱和高温不同胁迫处理下水稻内源激素含量的变化

不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05).

Different normal letters show significant differences between treatments at 0.05 level.

2.5 干旱-高温交叉逆境对水稻颖花形态的影响

图2-A～D表明，正常生长的水稻花药(A)开裂正常，单一干旱处理(B)和单一高温(C)水稻花药部分开裂或开裂不完全，干旱-高温交叉处理(D)明显比单一高温(C)花药开裂多.说明，适度的干旱预处理可能会缓解高温对水稻花药开裂程度的影响.

2.6 干旱-高温交叉逆境对水稻穗粒数和结实率的影响

由图3-A～B可知，水稻孕穗期进行单一高温、干旱以及干旱-高温交叉3种不同处理后水稻成熟期穗粒数和结实率均较CK有不同程度的下降.其中，水稻穗粒数分别降低21.1%、18.4%和8.5%；结实率分别降低12.9%、10.1%和4.1%.干旱-高温交叉处理较单一高温和干旱处理下水稻穗粒数和结实率均有显著的提高(P<0.05).以上结果表明，适当的干旱预处理可提高水稻对高温的抗性，进而显著提高水稻穗粒数和结实率.

3 讨论

植物在生长、发育过程中常遭遇高温、低温、盐渍以及干旱等不良环境的影响，且它们之间的影响往往是相互关联的[24].当植物进行某种抗性锻炼时，不仅增强了对这种逆境的抗性，且还增强了对其它逆境的抗性，即为植物的交叉适应性.植物对多种逆境的交叉适应性被众多学者所证实，而且也大量应用于生产实践，并且对植物交叉适应性的机制进行了不少的研究报道[25].研究表明，干旱预处理或盐预处理可提高水稻幼苗的抗冷性，低温预处理可提高水稻幼苗的抗旱性[26].短期的干旱预处理提高玉米幼苗对冷、热、干旱及盐逆境胁迫的抗性[27].干旱预处理花生幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白及Pro等含量均显著高于单一胁迫的，从而提高花生幼苗对盐胁迫的抗性[28].由此可见，交叉适应现象在植物中普遍存在，探讨干旱预处理对水稻高温胁迫的生理响应的研究对高效栽培有重要理论和实践指导意义.植物的逆境交叉适应是应答逆境的主要表现形式，涉及各种生理响应[29]，其中，渗透调节物质、抗氧化酶类和内源激素等在逆境胁迫中起到了至关重要的作用，这些物质诱导产生和适量积累对植物获得交叉适应具有重要意义.

A：正常生长CK；B：单一干旱处理D；C：指单一高温处理H；D：指干旱-高温交叉处理DH.A is CK；B is D；C is H；D is DH.图2 不同胁迫处理下水稻颖花的形态变化Figure 2 The change of morphology in rice panicle under the different stress treatment

图3 不同胁迫处理对水稻穗粒数和结实率的影响Figure 3 The effect of grain number and seeding setting rate in rice under the different stress treatment

3.1 干旱-高温交叉逆境对水稻渗透调节的影响

首先，渗透调节物质在植物抵抗逆境中发挥着重要作用，可通过降低细胞渗透势来维持细胞膜的结构和功能[30].其中，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是重要的渗透调节物质，当植物受到逆境胁迫时，可通过大量积累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸来提高细胞的渗透调节能力，是植物维持正常生长[31-32].本研究结果表明，水稻孕穗期经适度干旱预处理的水稻通过积累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，增强细胞渗透调节能力，从而提高吸水能力，来缓解高温对其的伤害，进而提高自身的抗性.从各胁迫处理表现来看，干旱-高温交叉处理下的渗透调节物质积累量最多，表明水稻孕穗期适度的干旱预处理有利于增强水稻的渗透调节能力，从而提高应对高温逆境的能力.

3.2 干旱-高温交叉逆境对抗氧化酶和丙二醛的影响

其次，逆境胁迫下，植物细胞由于大量的生物氧自由基的产生幷积累而受到伤害，这时植物酶促防御系统中的各种酶(SOD、POD和CAT等)的活性被激活，起到清除细胞自由基的作用，从而使细胞膜脂减少过氧化，提高植物对逆境的耐受能力[33-34].孕穗期水稻剑叶中的上述几种主要酶类在干旱和高温胁迫处理后均发生了不同变化.在本研究中水稻剑叶抗氧化酶活性均比正常生长的高，且干旱预处理水稻剑叶响应高温胁迫下抗氧化酶活性均比单一胁迫处理的高，且膜脂过氧化产物MDA含量明显下降，结果与前人研究结果一致[35].因此，在水稻孕穗期适度干旱锻炼增加了抗氧化酶清除活性氧能力，导致MDA含量下降，缓解细胞膜脂氧化，从而可以提高水稻的抗高温能力，也进一步显示交叉适应性现象的存在.

3.3 干旱-高温交叉逆境对水稻内源激素的影响

植物内源激素在植物的生长发育以及对逆境的反应中起着重要的作用[36-38].本研究中促进型激素(ZR、GA和IAA)在不同胁迫处理下，含量均有不同程度的下降；而经过干旱预处理，这些激素含量相比单一逆境处理均有显著的提高，从而调节水稻自身的生长发育.ABA作为重要的逆境激素和信号分子，多种逆境胁迫都能够诱导植物内源激素ABA的大量积累，对于提高植物的抗逆性起着重要作用[39-41].本研究中经过不同胁迫处理后水稻叶片中的ABA相比CK都有明显的积累，而经过干旱预处理后ABA含量相比单一胁迫处理有显著的增加，这也表明在水稻孕穗期适度干旱锻炼可能会通过ABA更多积累，以调控水稻的某些生理过程，来提高水稻的抗高温能力.SA是植物体内的一种新型激素,也参与调节植物的生长发育.重金属、热、干旱、盐等逆境能诱导植物体内SA的合成,缓解逆境对植物造成的伤害,增加植物的抗性能力[42].本研究中经过不同胁迫处理后水稻叶片中的SA相比CK都有明显的积累，而经过干旱预处理后SA含量相比单一胁迫处理的更高，这也表明在水稻孕穗期干旱锻炼可能会通过SA的更多积累，以调控水稻的某些生理过程，来提高水稻的抗高温能力.水稻在逆境胁迫下由于促进型激素Z、GA和IAA含量下降导致其生长发育受阻；同时抑制型激素ABA和SA的含量上升[43].在孕穗期对水稻适度的干旱锻炼增强了水稻内源激素调节能力，在提高水稻对高温抗性的同时，尽可能地维持水稻正常的生长发育.

3.4 干旱-高温交叉逆境对水稻穗粒数和结实率的影响

非生物胁迫会使花药不开裂或开裂不完全，进而导致柱头花粉数量减少，可萌发花粉少，影响受精作用[44].高温造成水稻减产的主要原因是花药的开裂度降低，使得散粉量减少，从而导致不育颖花数增加,导致结实率降低[45-46].本研究表明，干旱预处理可能会缓解水稻响应高温胁迫的伤害，在一定程度上降低了花药不开裂.在产量要素方面，孕穗期水稻受逆境胁迫后，水稻穗粒数降低，结实率降低，产量下降.这与石春林等[47-51]研究结论一致.本研究中得出适度的干旱预处理与单一高温和干旱胁迫相比，可提高孕穗期水稻对高温的抗性，进而表现在穗粒数和结实率上，穗粒数和结实率升高，在一定程度上降低了减产.

4 结论

干旱预处理孕穗期水稻响应高温胁迫的过程中，可通过积累渗透调节物质的含量、提高抗氧化酶活性和调节内源激素含量的变化来增强对高温的适应能力，减少不开裂及开裂小的花药，以最大程度的维持正常生长，增强抗性，使其穗粒数和结实率相对于单一高温和干旱胁迫有显著的提高，从而降低环境胁迫带来的减产风险，但其分子机制仍需进一步研究.