王统苗，张莘，陈博雯，常国斌，白皓，江勇，张扬，王志秀，陈国宏

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.扬州大学农业科技发展研究院，教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009)

中国是世界上鸭品种遗传资源最为丰富的国家，但是由于外来品种的大量引入和杂交，许多地方品种资源急剧减少，我国地方鸭品种资源的保种迫在眉睫[1].对我国地方鸭品种遗传结构进行分析，了解鸭品种的群体遗传结构和遗传分化，可以为保种和制作鸭产品提供新的思路[2].微卫星是广泛存在于真核生物基因组中的短串联重复序列，在群体遗传结构、群体遗传分化等方面广泛使用[3]，目前微卫星被用于遗传多样性研究方面的报道较多[4-5]，而在群体遗传结构方面的研究报道较少[6-7].

张扬等[8]利用12个微卫星标记对我国保存的6个鸭品种进行群体结构分析，发现‘临武鸭’与‘攸县麻鸭’‘高邮鸭’与‘山麻鸭’和‘广西小麻鸭’的遗传距离较近；黄种彬等[9]对‘连城白鸭’‘莆田黑鸭’‘金定鸭’‘山麻鸭’和‘福建番鸭’等5个鸭品种遗传结构分析，发现4个河鸭属品种遗传距离较近，与‘福建番鸭’亲缘关系较远；宋卫涛等[10]使用微卫星对蛋鸭品种遗传结构和遗传分化进行检测，发现11个蛋鸭群体中都存在复杂遗传基础的个体.

本研究根据Pritchard[11]提出的多位点等位基因推断群体遗传结构的模型分类法(Model-based clusterm ethod)-Structure程序对2018年新发现的遗传资源于‘田麻鸭’和‘润州凤头白鸭’，肉鸭代表品种‘北京鸭’‘樱桃谷鸭’，药用品种‘连城白鸭’，肉蛋兼用型品种‘吉安红毛鸭’共180只进行群体遗传结构分析，利用Fstat(V2.9.3)软件进行遗传分化研究，旨为阐明于‘田麻鸭’和‘润州凤头白鸭’与其他4个鸭种的遗传结构关系，为地方鸭品种资源开发利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 样本采集

6个地方鸭品种是‘润州凤头白鸭’(FT)(镇江天成农业科技有限公司)、‘连城白鸭’(LC)(福建省石狮国家级水禽基因库)、‘樱桃谷鸭’(YT)(江苏益客集团)、‘北京鸭’(BJ)(北京畜牧兽医研究所)、‘吉安红毛鸭’(JA)(江西省吉安红毛鸭资源保种场)、‘于田麻鸭’(YTM)(新疆于田县)，公母各15只.

1.2 鸭基因组DNA提取

于鸭翅静脉处采血，提取基因组DNA用传统苯酚-氯仿法[12]，测定浓度和纯度，稀释到100 ng/L，于-20 ℃保存.

1.3 微卫星位点

选择16对多态性丰富的微卫星引物AJ2725-80、AJ515884、CMO11、AY493256、CMO12、AJ515-898、AY493249、AJ515893、SMO13、AJ515895、AJ-272578、SMO4、AJ272579、AY493295、AJ272577、APL2作为试验位点.

1.4 STR分型测序

将PCR产物送到北京擎科新业生物技术有限公司进行STR分型测序.在ABI-3730XL DNA测序仪上检测基因型，GeneMapper4.0软件生成图谱文件同时读出片段长度、峰高、峰面积，同时判断纯合子(单峰)或杂合子(双峰).

1.5 统计分析

依据微卫星座位核心序列，对测序长度数据进行矫正，使用Microsatellite-Toolkit软件导出Fstat(V2.9.3)和Structure2.0软件所需的数据文件.将数据导入Structure2.0软件，设群体的假定推断类别数K值为2～6，K值为祖先群体.对每个K值，重复运行10 000次，每次在10 000 Burn-in的基础上运行10 000步.估计的群体遗传结构图由Bar Plot程序获得；NJ图由Tree Plot程序获得，独立类群图由Triangle Plot程序获得.每个K值下，用关键参数log(Alpha)的实时波动来检测Structure程序重复运行的连续性和可靠性.

1.6 统计原理

F-统计量包括总近交系数(Fit)、群体分化系数(Fis)、群体内近交系数(Fst)等3个参数.

1-Fst=(1-Fis)×(1-Fit)

式中，Ho：观察杂合度；Hs：平均期望杂合度.

2 结果与分析

2.1 等位基因数目在群体中的分布

16个微卫星座位在6个群体中共检测到141个等位基因，见表1.所有座位在6个鸭群体中检测到多个等位基因，表现为中高度多态性.其中，AY493256、AY493295、APL2座位等位基因最多，均为13个；CMO11、SMO13的等位基因最少，均为5个.对于6个鸭群体来说，‘于田麻鸭’的等位基因最多，其次为‘樱桃谷鸭’‘吉安红毛鸭’‘润州凤头白鸭’含有的等位基因最少.各个位点的等位基因在6个鸭群体中分布均匀，能较好地反映6个群体的遗传结构特性.

2.2 F-统计量的估计

表2为16个微卫星位点在6个鸭群体的F-统计量，16个SSR座位在6个群体内的固定系数(Fst)在0.049～0.325之间变动，其中位点AJ272578最低，位点AJ272577最高，平均值为0.210；6个群体的个体固定系数(Fit)的范围为0.17～0.774，最低的位点仍是位点AJ272578，但最高的位点为SMO13;整个群体的个体的近交系数(Fis)的范围为-0.029～0.689，其中位点AJ272580和AJ272577为负值，显示为杂合子过剩，其他位点都显示为杂合子缺失.

表1 16个座位上的等位基因数目及其分布

表2 16个微卫星座位在6个鸭群体内的F-统计量

平均值来自Jackknife,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

Mean estimates from Jack knife over loci，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001.

2.3 我国地方鸭品种群体类别推断

在假定群体的类别值K下，用log(Alpha)主要关键参数的实时波动来检测运行Structure程序的连续性和可靠性.由图2可见，log(Alpha)曲线图检测值稳定，幅度变化小，说明Structure程序构建的群体结构图稳定可靠.运用贝叶斯概率理论(Bayesian theory)，使用Structure程序对采样的180个个体进行鉴定.Structure程序还可以依据个体基因组分数推测迁移个体和是否具有复杂遗传基础的个体(基因组分数<0.800).结果表明，6个地方鸭品种群体概率值，‘于田麻鸭’最低为67.2%，‘连城白鸭’最高为85.3%，其他品种概率值在71.4%～82.2%之间.群体平均基因组分数分布见表3.‘于田麻鸭’‘北京鸭’和‘樱桃谷鸭’有迁移个体，‘润州凤头白鸭’‘连城白鸭’和‘吉安红毛鸭’无迁移个体.

表3 6个群体基因组分数在推断类别(K=6)中的分布

2.4 基于Structure程序分析群体间系统发生关系

图1显示，在K=2时，所有个体被Structure程序分为2个亚群，‘润州凤头白鸭’‘连城白鸭’‘于田麻鸭’构成一个亚群，‘北京鸭’‘樱桃谷鸭’‘吉安红毛鸭’构成另一个亚群.当K=3时，6个品种被推断为3个亚群，此时‘于田麻鸭’被单独分离出来.当K=4时，‘于田麻鸭’和‘吉安红毛鸭’分开，形成了2个独立群体，其他4个群体仍未发生分离.K=5时，‘润州凤头白鸭’‘北京鸭’‘连城白鸭’‘于田麻鸭’成为独立类群.当K=6时，‘樱桃谷鸭’和‘吉安红毛鸭’各自成为独立类群，最终形成6个独立群体.在6个群体独立类群图中，K=4时，‘连城白鸭’(Cluster4)和‘樱桃谷鸭’(Cluster 2)分成2个独立的类群，见图3左侧独立类群分布图；当K=5时，‘润州凤头白鸭’(Cluster1)和‘连城白鸭’(Cluster4)发生分离，形成独立类群，见图3中间独立类群分布图；当K=6时，‘连城白鸭’(Custer4)和‘于田麻鸭’(Cluster6)发生分离，见图3右侧独立类群分布图.

由Structure程序得到的系统聚类图(图4)，‘润州凤头白鸭’‘于田麻鸭’和‘樱桃谷鸭’聚为一类，‘北京鸭’‘连城白鸭’和‘吉安红毛鸭’聚为一类.

图1 Structure程序推断的群体结构图 Figure 1 Structure program of population structure

3 讨论

3.1 群体内遗传多样性分析

本文选择16对微卫星位点对我国地方6个鸭品种进行遗传结构和遗传分化研究.16个位点多态信息含量丰富，能够显示这6个品种的遗传多样性信息，进而可以描述这6个品种间的遗传结构关系.

图2 Structure运行时的log(Alpha)参数的时实变化图 Figure 2 The real-time change of the log (Alpha) parameter of the structure runtime

图3 各群体的独立类群分布Figure 3 Distribution of independent groups of each group

图4 Structure程序构建的群体NJ树Figure 4 The community NJ tree constructed by the Structure program

3.2 群体间的遗传变异

F-统计量结果显示群体间存在明显的遗传分化，群体间的遗传差异有21%来自群体间的差异，79%的变异来自个体间的差异，可能由于这6个品种之间相隔距离较远，致使其群体间基因分化系数比较大.此结果高于宋卫涛等[10]计算的11个蛋鸭品种的分化系数(12%)；低于李慧芳等[13]统计的华东区鸭品种间的分化系数(25.65%).

3.3 群体系统发生关系分析

Structure程序以贝叶斯概率理论为基础，采用马尔可夫-Monte Carlo模拟算法.当程序运行时，采用混合模型来设置检测到的群体的编号K[14].利用Structure程序对我国地方6个地方鸭品种群体进行群体分析，当K=6时，可以明显地将我国6个地方鸭品种区分开，说明K=6是最佳K值，这与张扬等[8]的研究结果一致；独立类群分布图可以看出‘连城白鸭’始终可以与其他5个鸭品种分离.NJ图显示‘于田麻鸭’和‘润州凤头白鸭’聚为一类，‘于田麻鸭’是新疆地方品种，是由野鸭自然交配而形成,和‘润州凤头白鸭’聚为一类，因为这2种鸭都是由野鸭进化而来；‘北京鸭’与‘樱桃谷鸭’聚为一类，‘樱桃谷鸭’是‘北京鸭’与英国当地品种杂交而培育出来的新品种，含有大部分‘北京鸭’的血液，且是肉用型的品种[5]，所以它们聚为一类.

本研究通过16个多态性较好的微卫星位点对中国地方6个鸭品种进行了遗传结构性和遗传分化研究，为我国地方鸭品种间的遗传信息和遗传关系提供更准确的依据，为合理开发利用并且保存各品种优良性状提供可靠的信息.