刘 鸿，王 春

(1.新疆维吾尔自治区水产科学研究所，农业部西北地区渔业资源环境科学观测实验站，新疆 乌鲁木齐 830000；2.上海海洋大学，上海 201306)

中华沙塘鳢(Odontobutissinensis)隶属鰕虎鱼亚目(Gobioidei)、塘鳢科(Eleotridae)，沙塘鳢属(Odontobutis)，又名沙乌鳢。体粗壮，头大而阔，稍扁平，腹部浑圆，后部侧扁。鳍两个，各鳍无硬棘。胸鳍大，圆形，尾鳍后缘稍圆，无侧线。体呈黑褐色，腹部淡黄，体侧有不规则的大块黑色斑纹，各鳍均具有淡黄色与黑色相间的条纹，其鱼卵具黏着丝，属黏性卵[1-2]。沙塘鳢属鱼类为东亚特有的淡水小型肉食性鱼类，因其肉质紧实无细刺，近几年来成为长江中下游一带的畅销经济鱼类，已成为中华绒螯蟹池塘养殖主要的混养对象。近年来有关中华沙塘鳢的研究相对较多，主要以分子生物学[3]、年龄生长[4]、种群分布[5]、人工繁育[6]及生物多样性[7]等研究为主。

随着扫描电子显微镜技术、生物样品制备以及脱水干燥等技术的成熟，扫描电子显微镜在生物学方面得到了较为广阔的应用。当前国内外对鰕虎鱼亚目鱼类行为学研究以及精子入卵扫描电镜观察都有较多报道[8-13]，但有关黏性卵精子入卵机制研究相对较少。Giulianini等[14]研究证明鰕虎鱼精子可完全穿过成熟鱼卵的黏着丝，解释了成熟卵细胞对于精子的选择机制。2009年何振邦[11]等对中华乌塘鳢精子入卵的整个过程加以捕捉并描述，讨论了单精入卵机制，对卵膜孔区的嵴状突起加以讨论。2014年曹晋飞[4]对中华沙塘鳢胚胎发育予以研究，获得不同发育阶段所需时间及有效积温。文章旨在通过对中华沙塘鳢受精过程的观察，探究该鱼的繁殖行为，以期提高人工繁育孵化率。

1 材料和方法

本实验所采样品均为野生中华沙塘鳢，捕获之后在暂养池暂养。本次试验采样总计两次，选择已达性成熟的雌雄个体共约300尾，雌雄比例2∶1，雌鱼平均体重为35.7 g，雄鱼平均体重32.4 g。中华沙塘鳢每年4月下旬性腺开始发育，繁殖期为5月上旬，水温15～20℃。在性腺发育成熟之后，提前16 h按个体体重注射绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体素激素(LRH—A2)，注射浓度按体重计量[15-17]。

催产后采用人工湿法授精。轻压鱼腹获取成熟生殖细胞，用生理盐水将精子稀释后以羽毛搅拌将其与成熟卵细胞均匀混合。授精后分别从5 s开始直至1 min，间隔5 s取受精卵固定，1 min后间隔30 s，所固定最长受精时间为5 min，每次固定卵子80～120粒。

样品用磷酸戊二醛溶液固定，其中戊二醛浓度为2.5%。样品固定之后采用逐级酒精脱水，乙醇浓度梯度分别为30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%，各级酒精脱水时间为10 min，之后保存于乙酸甲酯中，用以置换出乙醇[18]。

将处理之后的样品置于二氧化碳临界干燥装置中干燥，取出后用解剖针、解剖刀、镊子以及手术剪在体视显微镜下去除黏着丝，并固定在扫描电镜样品台的导电胶上，喷金之后观察。

2 结果

2.1 精子的外部形态

中华沙塘鳢的精子由头部、颈部、体部和尾部4部分组成，全长20～25 μm。头部椭圆形，2.25±0.25 μm，短轴1.00±0.20 μm。颈部较短，颈部之后为体部，长度约为1.5 μm左右。体部之后为精子的尾部，可分为前、中、后三部分，尾部的总长为19.0±1.0 μm(图1)。

图1 中华沙塘鳢精子(a:放大倍数3000;b:放大倍数5000)

2.2 成熟卵子的外部形态

中华沙塘鳢的成熟卵呈鲜艳黄色，为圆球形，卵子直径为1.30±0.02 mm。黏着器位于卵子动物极一端，由基底、筛网和黏着丝三部分组成。揭开成熟卵子的卵膜，观察卵核内部结构，扫描电镜下卵核的表面为突起的小颗粒，不平坦。卵膜厚度11.8±0.8 μm。中华沙塘鳢成熟鱼卵黏着丝长度可达575.0±25.0 μm，筛状圆柱高度为50.0±3.0 μm。粘着器底层筛孔数量为每周80左右，上层数目较多。底层筛孔最大，从下往上筛孔直径逐渐减小，有5～6层。底层筛孔外径约7.5±2.5 μm，高度10 μm左右，上层筛孔大小不一，筛孔长度可达20 μm以上，宽度5.5±0.5 μm。中华沙塘鳢成熟卵膜表面有嵴状突起，将成熟中华沙塘鳢黏着丝剔除可观察到卵膜孔区，黏着丝内部卵膜平滑，无隆起的嵴，其正中为受精孔，卵膜孔区直径为172.5±2.5 μm，受精孔为椭圆形，长径为7.2±0.2 μm，短径4.5±0.2 μm(图2)。

2.3 精子入卵过程

对固定的中华沙塘鳢受精卵观察可知，中华沙塘鳢精子入卵过程为：精子通过成熟卵细胞近动物极筛栅底层筛孔，进而到达受精孔，单个精子入卵后受精孔关闭，外部精子随即降解，卵细胞进入胚胎期(图3)。

2.3.1 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精5 s 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精5 s，精子主要集中于卵细胞黏着丝下卵膜表面，500倍镜下可观察到筛网孔前聚集的大量精子，在扫描电镜(SEM)下能够清楚地看到其外部形态。

2.3.2 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精15 s 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精15 s，大量精子开始进入筛网孔，准备穿过筛网，4 000倍镜下，可观察到筛孔外部大量的精子尾部，表明已有精子进入筛网孔，且精子在进入筛网孔时已经开始相互竞争。

2.3.3 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精20 s 中华沙塘鳢授精20 s，大量精子已进入黏着器底部筛网孔，筛网外部仅剩余少量精子，且成熟卵细表面开始出现絮状物。

2.3.4 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精25 s 去除中华沙塘鳢受精卵黏着器底部黏着丝观察发现，中华沙塘鳢授精25 s，精子正处于穿过筛网孔阶段，在筛网孔横截面上可以看到大量的精子，并有少量絮状物产生。

2.3.5 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精55 s 授精55 s，大量精子完全穿过筛网孔，进入卵膜孔区，但部分精子进入卵膜孔区后会反向游动，甚至游离卵膜孔区。

2.3.6 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精60 s 在中华沙塘鳢成熟卵授精60 s，受精孔内已有精子进入，同时受精孔外的精子已经开始解体，解体从精子的尾部开始，直至头部后完全解体。

2.3.7 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精120 s 中华沙塘鳢成熟卵细胞授精120 s，精子进入受精孔，随后受精孔关闭，卵膜孔区不再平整，受精卵表面精子加速解体。之后成熟卵完成受精过程，吸水后进入胚胎发育阶段。

图2 中华沙塘鳢成熟卵子结构

3 讨论

3.1 中华沙塘鳢生殖细胞结构及功能

中华沙塘鳢卵为黏性卵，当卵子成熟后雌性将鱼卵产于水中，成熟卵细胞遇水立即产生黏性，卵细胞下端黏着丝具有极强的黏附能力，能稳固的将卵细胞黏连于基质之上，成熟雌性排卵后在整个受精以及发育过程中都能牢固附着于底质，有助于提高受精率和孵化率。分析认为，黏着丝附着于雄性精子轨迹有助于保持卵膜孔区清洁，提高受精率[11]。就生殖细胞结构而言，中华沙塘鳢成熟精子与中华乌塘鳢精子区别较大。中华乌塘鳢(Bostrichthyssinensis)成熟精子头部为圆形[11]，而中华沙塘鳢精子头部为椭圆形，且中华沙塘鳢精子较中华乌塘鳢精子头部以及尾部大。但中华沙塘鳢与中华乌塘鳢成熟卵细胞的大小相近、结构相似，黏着丝、卵膜厚度以及筛孔大小及长度相差不大。主要的区别在于卵膜孔区结构，中华沙塘鳢卵膜孔区较为平整，无隆起的嵴存在，而中华乌塘鳢卵膜孔区有12～16条由基地隆起而形成的嵴状结构，以受精孔为中心呈辐射状分布，称为辐射嵴，且个辐射嵴组成若干个扇形区(图4)[11]。

3.2 中华沙塘鳢繁殖行为学与生殖细胞结构关系

与草鰕虎鱼(Zosterisessorophiocephalus)繁殖行为学相似，中华沙塘鳢繁殖前由雄鱼率先产出精子轨迹，继而雌鱼释放成熟卵细胞并附着于产卵基质，精子激活后开始游动并使卵细胞受精[19]。2000年Giulianini等通过使用扫描电镜对鰕虎鱼精子入卵的过程予以观察，证实了精子完全可以通过黏着丝成功到达受精孔[20]，与本文研究结果相符。黏着丝对成熟卵细胞准确受精不仅不会差生阻碍，而且能够保证整齐黏附于同一基质的大量鱼卵同时受精，进而有效降低精子进入卵细胞的能量消耗。

图3 中华沙塘鳢精子入卵过程

图4 中华乌塘鳢生殖细胞结构