苏日娜，牧 丹，那生桑

(内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110)

紫草为中医和蒙医常用药材，最早载于《神农本草经》，历代本草均有收载。2015年版中国药典收载了紫草科软紫草属植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst)和内蒙紫草(ArnebiaguttataBunge)的干燥根，具有清热凉血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤[1]。

蒙医药中常称紫草为毕日木格(《认药白晶鉴》)，蒙医药古籍均有记载。《无误蒙药鉴》载其：“生于砂质硬土地，茎、叶具毛、叶灰色粗糙，根深红棕色、味甘、涩者性烈，质佳……根极细，叫吉木格者次。”上述植物生境、形态特征与蒙医所沿用的紫草环境、形态特征基本一致，故认定历代蒙医药文献所载的东日拉即毕日木格[2]。与中医的炮制方法不同[3]，紫草油和紫草膏在蒙医药中的炮制方法主要有奶煮或泡、制炭两种，这两种炮制品药理功效不同。《蒙药炮制学》记载：“紫草的奶炮制品可增强肺热的治疗功效，紫草炭制后有助于治疗各种原因引起的出血症。”[4，5]本研究以传统蒙医炮制理论为基础，将紫草生品经牛奶炮制后，测定其有效成分的含量，并考察炮制前后的含量变化，为今后蒙医药中紫草奶炮制品的质量标准及药理实验提供依据。

1 仪器、试药及药材

1.1 仪器

旋转蒸发仪RE52CS9(上海亚荣生化仪器厂)；KH5200DE型数控超声仪(昆山禾创超神仪器有限公司)；SHB-B95T型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；恒温水浴锅B-220(上海亚荣生化仪器厂)；薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂有限公司)；硅胶板G(青岛硅创精细化工有限公司)；玻璃毛细管(华西医科大学仪器厂)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)； TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Ichromw5100(大连依利特分析仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品阿卡宁(中国食品药品检定研究院，批号：111689-201504)；新疆紫草(中国食品药品检定研究院，批号：121430-201504)；甲酸、甲醇和乙腈为分析纯；石油醚(60～90℃)为分析纯；水为Milli-Q超纯水。

1.3 采集的药材

全部批次的药材经内蒙古医科大学渠弼教授鉴定为紫草科植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.)的干燥根。见表1。

表1 采购的紫草批号和产地

2 方法与结果

2.1 紫草奶炮制工艺流程

取新疆紫草500 g，加10倍鲜牛奶(500 mL)，煮沸。待煮到10 min后较粗的药材完全煮透，药材颜色变浅；将煮好的药材转移到烧杯中，用蒸馏水反复清洗至没有奶渍；将清洗好的药材放置于滤纸上铺平，放到60 ℃的烘干箱中进行烘干，直到干燥程度与原药材相同为止。

按煎煮时间为指标，分别测定煎煮10 min、15 min、20 min和30 min的炮制品中β,β′二甲基丙烯酰阿卡宁的含量，含量随煎煮时间增加而降低，因为10 min内牛奶已经浸透到全部药材内部(包括最粗的根状药材)，所以选择10 min的炮制时间。

关于加入的牛奶量，根据文献记载，10 kg的药材浸泡要15 L的牛奶(1.5倍)。但在实验室炮制50 g的时候，若只是加入75 mL牛奶，则不能完全浸泡药材，所以增加了牛奶的量。炮制后的药材具有奶香味。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 实验方法 取炮制品粉末0.5 g，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取紫草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121430-201504)0.5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(2015版药典通则0502)试验，吸取两种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.5∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；再喷以10% 氢氧化钾甲醇溶液，斑点变为蓝色。见图1。

图1 薄层色谱

3 含量测定

3.1 羟基萘醌总色素

取本品适量，在50 ℃干燥3 h，粉碎(过三号筛)，取约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加乙醇至刻度，4 h内连续振摇，滤过。精密量取续滤液5mL，置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在516 nm波长处测定吸光度，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系数E=242计算，即得。本品含羟基萘醌总色素以左旋紫草素(C16H16O5)计。见表2。

表2 新疆紫草不同样品炮制前后羟基萘醌总色素含量变化 (%)

3.2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量测定

3.2.1 色谱条件 色谱柱：Sinochrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相:乙腈-0.15%甲酸水溶液(70∶30),流速：1 mL·min-1；检测波长：275 nm；柱温：30℃。β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111689-201504)。见图2。

3.2.2 标准品溶液配制 称定阿卡宁对照品6.23 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，作为1号对照品；吸取1号对照品溶液5 mL，转移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，作为2号对照品溶液；吸取2号对照品溶液2.5 mL转移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，作为3号对照品溶液；吸取3号对照品溶液2.5 mL，转移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，作为4号对照品溶液；吸取4号对照品溶液2.5 mL转移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，作为5号对照品溶液。上述阿卡宁对照品溶液的浓度依次为1号0.632 mg/mL,2号0.316 mg/mL,3号0.079 mg/mL,4号0.02 mg/mL，5号0.002 mg/mL。

3.2.4 供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33kHz)30 min，放冷，再称定重量，用石油醚(60～90℃)补足减少的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加流动相溶解，转移至10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。见图3。

3.3 专属性考察

图2、图3为对照品及奶紫草的HPLC色谱，结果表明丙烯酰阿卡宁保留时间一致，分离度良好，HPLC测定方法专属性良好。

图2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品的HPLC色谱

图3 奶紫草的HPLC色谱

3.4 重现性考察

取同一批新疆紫草奶炮制样品粉末(批号：1606102101)6份，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，分别进行测定，记录色谱，计算含量。结果，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁含量的RSD=2.71%。见表3。

表3 重复性考察结果

3.5 稳定性考察

精密吸取同一新疆紫草供试品溶液(批次：1606102101)20 μL，分别于0、1、2、4、8、12 h按上述色谱条件进样测定，记录色谱。结果，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的峰面积的RSD=0.78%。

3.6 线性范围

精密称取β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁6.32 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，既得0.632 mg/mL的对照品储备液。用甲醇稀释配制成浓度为0.316 mg/mL、0.076 mg/mL、0.02 mg/mL、0.002 mg/mL的一系列标准品溶液。滤头过滤，吸取20 μL，按上述色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，标准品溶液浓度(X)为 横坐标，进行线性回归，得线性方程为Y=2295 2X+33.915(r=0.999 9)。

3.7 加样回收率

取已知含量的奶紫草粉末约0.25 g，共6份，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入一定量的对照品，使供试品中待测定组分含有量与对照品的加入量比值在1∶1.5、1∶1、1∶0.5左右，按上述方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，分别进行测定，记录色谱，计算含量。结果见表4。

3.8 样品含量测定

6个批次样品各取3份，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，分别用外标法计算出6个批次样品中β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量。结果见表6。

4 讨论

现代药理学研究证明，紫草中主要活性成分为羟基萘醌色素类成分，包括紫草素及其衍生物，这类物质主要有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[6]。针对紫草的质量控制研究有一些报道，郝鹤等[7]采用梯度洗脱 HPLC 法测定了新疆紫草中的7种萘醌类成分；Min Cheng 等[8]采用HPLC法测定了新疆紫草和内蒙紫草中的左旋紫草素和 β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡宁的含量，并对其进行了分析；毛艳和 MEI LIAO 等[9,10]采用液质联用技术对紫草药材的化学成分进行了快速鉴定。

表4 加样回收率试验结果

表6 样品含量测定结果

经过牛奶炮制后的紫草生品，薄层鉴别结果表明其萘醌成分没有明显变化，而高效液相法定量分析后发现炮制品的紫草素类化合物峰的含量均比生品降低。其中以β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡宁对照品，测定炮制品的羟基萘醌总色素的含量为0.56%～2.5% ；β，β’-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量为0.020%～0.52%，分别比生品低1.7%～4.2%和0.07%～0.34%。2015版药典中记载的紫草含量测定方法通过方法学考证适用于紫草的奶炮制品。为今后的蒙医药中紫草的奶炮制品的质量标准及药理实验提供了实验依据。