许 耀

(郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院 药学部，河南 郑州 450053)

瓜子金为远志科植物瓜子金PolygalajaponicaHoutt.的干燥全草，收载于2015版药典，辛、苦、平，归肺经，具有祛痰止咳、活血消肿、解毒止痛等功效，临床用于治疗咳嗽痰多、咽喉肿痛；外治跌打损伤、疔疮疖肿、蛇虫咬伤[1]。瓜子金中主要含有皂苷类、黄酮类、有机酸类、挥发油类等成分[2]，能镇咳祛痰、益智安神、活血散瘀，民间应用十分普遍且疗效显著[3]。

从植物中提取出来的多糖具有十分重要而且广泛的生理活性，如提高免疫、抗肿瘤、降低血脂、降血糖、抗炎、抗疲劳、抗氧化、抗衰老等[4-7]。目前提取多糖较常用的提取方法有水提取法、碱提取法、酶提取法等[8-10]。其中水溶性多糖常用热水提取法，所得的多糖溶液通过离心除去不溶物，然后利用多糖不溶于高浓度乙醇性质，进行沉淀，此方法不需要特殊的设备，成本低、操作简单，适合大规模生产。本实验通过考察水提方法，确定最佳提取工艺条件，同时建立瓜子金多糖的含量测定方法，以期为瓜子金多糖的研究和进一步工业化生产提供依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

TU-1810型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)； Satorius-CPA225D十万分之一天平(奥多力斯科学仪器有限公司)；DZF-300型电热恒温鼓风干燥箱(郑州长城科工有限公司)；SHZ-D型循环水式多用真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；LD-25离心机(北京京立仪器有限公司)。

1.2 试剂

D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201206)；浓硫酸、苯酚、95%乙醇、无水乙醚等试剂均为分析纯。

1.3 实验药材

瓜子金药材购买于郑州市东升大药房，经鉴定为中药远志科植物瓜子金PolygalajaponicaHoutt.的干燥全草，经粉碎并过40目筛，得瓜子金粗粉。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 葡萄糖标准品溶液的配制 精密称取105 ℃烘干至恒重的无水葡萄糖标准品100.0 mg，溶解到100mL容量瓶中定容，反复上下摇匀，即得浓度为1000.0 μg/mL的葡萄糖储备液，置于4 ℃冰箱中备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取瓜子金药材粉末1.0 g，精密称定，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，回流提取25 min，过滤，弃去滤液，滤渣挥干溶剂后加乙醇50 mL加热回流40 min，过滤，滤渣加蒸馏水加热回流2次，每次加蒸馏水50 mL，每次提取时间1.5 h，滤液合并，定容至100 mL，取1mL定容至5.0 mL，即得瓜子金多糖供试品溶液。

2.1.3 最佳测定波长的选择 精密吸取葡萄糖储备液1.0 mL，置于25 mL具塞试管中，另取蒸馏水1.0 mL置于另一25 mL具塞试管中，作为空白对照，分别加入1.0 mL 5%苯酚饱和溶液和浓硫酸溶液5 mL显色，震荡摇晃均匀，室温放置40 min后，于200～900 nm进行全波长扫描。由扫描结果可知，葡萄糖储备液在490 nm处有最大吸光度，故选490 nm为测定波长。

2.1.4 标准曲线的建立 分别精密吸取葡萄糖储备液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 mL于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，反复上下摇匀，得葡萄糖浓度分别为20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 μg/mL的标准溶液。分别量取上述葡萄糖标准液和蒸馏水空白溶液1.0 mL于25 mL试管中，按照“2.1.3”项下实验操作，结果如表1。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程为：Y=0.014 5X+0.021 3，r2=0.999 6(n=6)，结果表明，葡萄糖浓度在20.00～70.00 μg/mL范围内，与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度实验 取浓度为30.00 μg/mL的葡萄糖标准溶液1.0 mL，按照“2.1.3”项下操作，连续测定5次，计算吸光度的RSD值为0.526%，这表明仪器精密度良好。

2.1.6 重现性实验 配置40.00 μg/mL的葡萄糖标准溶液6份，各取1.0 mL入具塞试管中，按照“2.1.3”项下操作，测定多糖含量，计算吸光度的RSD为1.27%，表明该方法重现性良好。

2.1.7 稳定性实验 取浓度为40.00 μg/mL的葡萄糖溶液1.0 mL，依 “2.1.3”项下操作，每隔15min测定吸光度一次，连续测定2 h，其相对标准偏差RSD值为0.218%，表明样品在2 h内具有良好的稳定性。

2.1.8 回收率实验 准确精密称取样品多糖(糖含量为10.90%)6份，每份约2.0 mg，分别加入浓度为43.6 μg/mL葡萄糖溶液5 mL定容至25 mL容量瓶中，混匀，各溶液取1.0 mL，依照“2.1.3”项下操作，测定吸光度，计算回收率，得平均回收率为99.5%，RSD=1.12%，实验结果见表1，可见该方法具有良好的回收率。

表1 回收率实验结果

由上面的结果可知，该方案的精密性、重现性、稳定性和加样回收率实验均稳定良好，该实验方法稳定、成熟，可用于瓜子金多糖含量测定的进一步研究。

2.2 瓜子金多糖水提单因素考察

2.2.1 提取温度对多糖提取的影响 取瓜子金药材粉末(过40目筛)5份，各10 g，分别在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴条件下提取多糖，料液比为1∶20，提取时间3 h,提取2次，提取液合并，离心去残渣，然后浓缩至固液比1∶2(药粉重量∶溶液体积)，加95%乙醇至醇沉浓度为80%，置于4 ℃冰箱中静置过夜，离心得多糖沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空干燥得瓜子金粗多糖，并计算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量2个指标作为衡量提取效率的条件，得综合评分计算结果，以综合评分与提取温度做曲线。结果见图1。

图1 提取温度对瓜子金多糖提取率的影响

由图1可以看出，在90 ℃之前，随着提取温度的升高，综合评分逐渐增加，而超过90 ℃后，提取效率综合评分增加缓慢，在100 ℃时评分最好，因此，本实验选择100 ℃作为最佳提取温度。正交实验设计选择提取时间为80 ℃、90 ℃、100 ℃ 3个水平。

2.2.2 料液比对多糖提取的影响 取瓜子金粉末5份，每份各10 g，分别以1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40五种不同的料液比提取多糖，提取温度为100 ℃，提取时间3 h，提取2次，合并提取液，以下实验步骤如“2.1.1”操作。计算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量两个指标衡量提取效率，并计算综合评分，以综合评分与料液比作曲线图。结果见图2。

图2 瓜子金多糖料液比提取结果

由图2可以看出，随着料液比的加大，当料液比为1∶20时综合评分开始显著增加，当达到1∶30时为最好，考虑到经济效益，随着提取溶剂的加大，成本也会大幅增加，由于在料液比1∶20和1∶30之间显著增加，所以正交实验料液比选取1∶20、1∶25、1∶30三个水平进行考察。

2.2.3 提取时间对多糖提取的影响 取瓜子金粉末5份，每份10 g，分别在0.5、1、2、3、4 h五个不同提取时间下提取多糖，料液比1∶30，提取温度为100 ℃，提取3次，每次2h，合并滤液，以下实验步骤如“2.1.1”操作。计算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量两个指标衡量提取效率，综合评分如下，以综合评分与提取时间作曲线。结果见图3。

由图3可以看出，随着提取时间的增加，瓜子金多糖提取效率逐渐增加，当到3 h为最佳，当时间在长综合评分稍微有些下降，所以本实验正交实验时间选取2 h、3 h、4 h三个水平。

图3 提取时间对瓜子金多糖提取率的影响

2.2.4 提取次数对多糖提取的影响 取瓜子金粉末5份，每份10 g，提取次数分别为1、2、3、4、5次，料液比为1∶30，提取温度为100 ℃，提取时间2 h，合并滤液，以下实验步骤依“2.1.1”操作。计算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量作为衡量提取效率的两个指标，并计算得综合评分，以综合评分与提取次数作曲线。结果见图4。

由图4可以看出，随着提取次数的增加，综合评分逐渐增大，从第2次开始，综合评分增加趋势变缓，考虑到经济因素，本实验正交实验设计选择提取2、3、4次3个水平。

图4 瓜子金多糖提取率受提取次数的影响

2.2.5 醇沉浓度对多糖提取的影响 取瓜子金粉末5份，每份10g药材，料液比为1∶30，提取温度为100℃，提取时间2h，提取3次，合并滤液，离心去残渣，提取液浓缩至固液比1∶1.5，加95%乙醇至不同的乙醇醇沉浓度，分别为70%、75%、80%、85%、90%，置4℃冰箱中静置过夜，以下实验操作如“2.1.1”。计算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量为衡量提取效率的两个指标，综合评分计算如下，以综合评分与醇沉浓度作曲线。结果见图5。

图5 醇沉浓度对瓜子金多糖提取效果的影响

由图5可以看出，随着醇沉浓度的增加，综合评分不断增加，当醇沉浓度达80%时，综合评分最大，因此，本实验选择80%乙醇最为最终醇沉浓度。

2.3 瓜子金多糖水提正交实验优选最佳水提工艺

2.3.1 因素水平表的设计 基于以上各单因素实验结果，选择提取温度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)四个因素作为参考因素，每个因素均选取3个水平，实验按L9(34)正交表安排。

2.3.2 数据的处理方法 实验结果以瓜子金多糖得率和糖含量作为衡量提取效率的双重指标，根据多糖得率(a)和糖含量(b)的作用，用该加权评分法(权重各占50%)综合评估瓜子金多糖提取条件。评分标准：以各项值除以该列的最大值，再乘100，即为该项的得分，这样可把多糖得率和糖含量转化为0～100之间的数值，对这两项指标进行求和，运用公式M=0.5a+0.5b，即得综合评分(M)。

2.3.3 瓜子金样品制备及指标测定 分别称取瓜子金粉10 g，按照正交设计表的各个因素水平进行提取，每个实验平行1份，提取液浓缩至料液比1∶1.5，80%醇沉，4 ℃冰箱中静置过夜，以下实验步骤如“2.1.1”操作，计算多糖得率及含量。正交试验设计的因素水平见表2，正交试验结果见表3，正交试验分析见表4，方差分析见表5。

表2 水提工艺因素水平

表3 实验结果

表4 正交实验及结果

表5 方差分析

注：**P<0.01；*P<0.05；F0.01(2,9)=8.02；F0.05(2,9)=4.26。

正交实验结果表明温度和提取次数对实验结果影响极显著(P<0.01),料液比和提取时间对实验结果影响显著(0.01A>C>B。根据实验结果选取最佳的提取工艺为A2B2C1D2，即取瓜子金药粉(过40目筛)，加入25倍量水，90℃回流提取3次，每次2h。

2.4 验证试验

以上实验得出瓜子金药材的最佳提取工艺条件为：取瓜子金药材打粉过40目筛，加水25倍量，90℃回流提取3次，每次2h，过滤离心，合并提取的滤液，浓缩至固液比1∶1.5(药粉重∶溶液体积)，加乙醇至最终醇沉浓度为80%，置于4℃冰箱中静置过夜，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，挥干，即得瓜子金多糖。为考察上述工艺的稳定性，按该最佳工艺方法提取3份，分别测定计算多糖得率及糖含量，计算平均多糖得率为12.4%，平均糖含量为11.3%。

3 讨论

目前对中药瓜子金的研究主要集中在皂苷类等成分的研究[11]，对瓜子金多糖的提取工艺及含量测定均未见报道。本文首次建立瓜子金多糖的含量测定方法并对其提取工艺进行研究。对多糖提取工艺的研究，目前主要以多糖的提取率为指标对其提取工艺进行考察[12-13]，而未考虑多糖产物的纯度，因此，此单指标确定的提取方法存在一定的局限性，为进一步完善提高多糖提取工艺，本研究采用了双指标方法对中药瓜子金多糖的提取工艺进行优化。

本试验建立了瓜子金多糖的含量测定方法，同时对影响瓜子金多糖提取率和多糖含量的提取温度、料液比、提取时间、提取次数、醇沉浓度等5个因素分别进行了单因素分析，后利用正交设计考察提取温度、料液比、提取时间和提取次数对瓜子金多糖提取率和多糖含量的影响，以瓜子金多糖得率和多糖含量作为衡量提取效率的双重指标，采用加权评分方法综合评估瓜子金多糖的提取条件，方法科学可行、操作简单，所得产物瓜子金多糖的提取率及纯度均较高，为瓜子金药材及其多糖的进一步开发提供了科学依据。