宋俊杰，范军朝，王 莹，郑孝振

(河南大学第一附属医院，河南 开封 475000)

环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)不仅是细胞毒性化疗药物，同时属于烷化剂类免疫抑制剂，可破坏DNA结构，阻断其复制，从而导致细胞死亡。因此，环磷酰胺可作为广谱抗肿瘤药物，或治疗自身免疫性疾病以及器官移植后的免疫排斥反应等[1]，也可作为制造免疫低下模型的工具药。山药多糖是山药重要的活性物质，具有多种药理作用，如调节免疫、抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤、降血糖、保护肝脏、促进肾脏再生修复、改善消化功能等[2]。本文旨在探究环磷酰胺造模后机体脾脏组织的变化，以及不同剂量山药多糖对小鼠脾脏的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与动物

动物：SPF级KM小鼠，雄性，32只，体质量18～22 g，购自河南省动物实验中心，合格证：SCXK(豫)2010-0002。动物饲料20 kg购自河南省动物实验中心。所有实验动物饲养于河南大学第一附属医院肿瘤分子免疫实验室，环境清洁，温度17～23 ℃，相对湿度45%～55%，光照随昼夜变化，自由饮水、摄食。

材料：注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)；山药多糖(纯度99%，杨凌慈缘生物技术有限公司)；戊巴比妥钠(规格：5 g，北京普博斯生物科技有限公司)；注射用生理盐水。

1.2 实验方法

小鼠适应性饲养1周后，随机将小鼠分为正常对照组(C组，n=8)，环磷酰胺+盐水组(N组，n=8)，环磷酰胺+山药多糖中剂量组(M组，n=8)，环磷酰胺+山药多糖高剂量组(H组，n=8)。山药多糖中剂量为150 mg/kg，高剂量为250 mg/kg。预先腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，5天，建立小鼠免疫低下模型，5天后再分别给予不同剂量山药多糖处理灌胃每天1次，持续14天。于第15天采集血液和器官标本，以50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，尾部横切后足量采集尾静脉血，全部采集完成后立即行外周血检测。于小鼠腹部正中纵行切开，充分暴露腹腔内脏器，分别辨认并取出完整的脾脏和胸腺，4℃生理盐水清洗干净后拭去水分，称重。分别取部分脾脏置于4%多聚甲醛溶液中固定后待病理学观察。

1.3 观察检测指标

①体重：每次给药前称重，观察小鼠体态改变，称取小鼠体重并记录；②脾脏指数：脾脏指数=脾重/体重(%)；③脾组织病理学：将固定后标本，经脱水、透明、浸蜡、包埋、染色、封片等步骤后于显微镜下观察肝脏和脾脏微结构的变化；④血细胞计数：应用血细胞分析仪检测小鼠外周血中红白细胞计数。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 体重

注射环磷酰胺后，与N组相比，其他各组小鼠体重无统计学差异(P>0.05)；与N组相比，C组小鼠在T9～T15期间体重明显增加。见图1。

注： 与N组相比，*P<0.05。

2.2 脾脏指数

与C组相比，N组小鼠肝脏指数明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与N组相比，M组和H组小鼠肝脏指数增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)；M组和H组小鼠脾脏指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠脾脏指数比较

注：与C组相比，*P<0.05；与N组相比，#P<0.05。

2.3 脾脏组织病理学变化

C组：正常脾脏组织，红髓和白髓可分辨；N组：脾小节结构不清，增生明显，红髓和白髓分辨不清；M组：部分脾小节结构不清，轻度增生，可分辨出红、白髓；H组：可分辨出红、白髓，脾小节结构基本正常。见图2。

图2 脾脏组织病理学改变(×40)

2.4 血细胞计数变化

与C组相比，N组小鼠白细胞计数明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与N组相比，M组和H组小鼠白细胞计数明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；M组和H组小鼠白细胞计数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：与E组相比，*P<0.05；与M组相比，#P<0.05。

3 讨论

注射环磷酰胺后，各组小鼠体重均有所下降。但与N组相比，正常对照组小鼠在第5天后体重增加，且在第9～15天差异有统计学意义。由此可见，注射环磷酰胺能使小鼠体重下降，但应用山药多糖后，体重稍有改善。有文献[3]显示，环磷酰胺组小鼠体重与空白对照组相比，多数体重下降，但差异不具有显著统计学意义。徐光翠等[4]研究表明，与镉染毒模型组相比，山药多糖剂量组体重随剂量(50，200，500 mg/kg)的增加而增加。与此研究中山药多糖剂量相比，本研究的剂量相对较小。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官[5]。脾的重要功能是滤过，可通过巨噬细胞清除衰老的红细胞或通过T细胞对其他抗原产生应答。故而，脾大(体积和质量的增加)或脾指数增长在一定程度上反映了脾脏结构及功能的变化[6-7]。本研究发现，注射CTX后，N组小鼠脾脏指数明显降低，与C组相比差异具有统计学意义；M组和H组小鼠脾脏指数明显增加，与N组相比差异具有统计学意义。袁羿[8]在实验研究中发现，BaLb/C雄性小鼠经连续腹腔注射CTX 80 mg/kg 3天后，小鼠脾脏指数明显下降。另有研究[9]发现，环磷酰胺组免疫器官指数(脾脏指数、胸腺指数)均明显低于空白对照组，差异具有统计学意义。而在盐酸林可霉素致肠炎模型中也发现，与正常对照组相比，纳米山药多糖组免疫器官指数显著提高[10]。王德青等[11]发现，相较于空白对照组，山药多糖组可明显提高脾脏指数。并且随着山药多糖剂量的增加，脾脏的增重效果更明显，脾脏指数不断上升[12]。由此可见，注射CTX降低了小鼠的脾脏指数，而山药多糖可以提高CTX所致的脾脏指数低下。

脾在胚胎早期具有造血功能，成年后仍可在某些病理情况下发挥造血功能，但对于机体免疫系统而言，脾脏在免疫应答方面发挥巨大作用，它是对进入血液的抗原性物质产生免疫应答的重要部位，无论是体液免疫或是细胞免疫均可导致脾结构的变化。本研究发现：C组脾脏组织正常，红髓和白髓可分辨、结构清晰；N组脾小节结构不清，增生明显，红髓和白髓分辨不清；M组部分脾小节结构不清，轻度增生，可分辨出红、白髓；H组可分辨出红、白髓，脾小节结构基本正常。包汇慧等[13]在CTX对大鼠脾细胞抑制作用的研究中也发现，在20 mg/kg CTX灌胃给药的大鼠中组织检查发现脾内结构破坏，甚至出现纤维增生。有文献报道[9]称：“空白对照组脾脏被膜较厚，并伸入实质形成小梁；脾脏实质由红髓和白髓组成，其界限分明，白髓内淋巴细胞较为密集”“CTX组脾脏组织结构杂乱，红髓与白髓界限不清，白髓结构散乱，脾小结明显变小，淋巴细胞较为稀疏。”此项结果表明，CTX灌胃造成了脾脏病理学损伤，中剂量和高剂量的山药多糖可改善CTX所致的脾脏组织病理学损伤，且以高剂量较为明显。

白细胞是人体血液中非常重要的有吞噬功能的细胞，其可以吞噬异物并产生抗体，是人体防御系统的重要防线。本研究发现，与C组相比，N组小鼠白细胞计数明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与N组相比，M组和H组小鼠白细胞计数明显升高(P<0.05)。有研究表明，使用CTX以后，雄鼠外周血液系统中白细胞总数有所下降[14]。在加味四君子汤对CTX(80 mg/kg，连续3天)致免疫低下小鼠的免疫调节研究中发现，第7天后检查白细胞数目明显减少，在第11天白细胞数目明显升高[15]。本研究也证明了CTX可降低血液中白细胞计数，并且同时表明低剂量和高剂量山药多糖灌胃可以提高CTX所致的白细胞低下。由此推测，山药多糖对临床肿瘤患者应用CTX化疗后所致的白细胞低下也有相应的提升作用，但这一推测有待进一步研究证实。