杨智慧 ，程 诚 ，高晓燕

（1.江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006； 2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001）

杏贝止咳颗粒由麻黄、前胡、浙贝母、桔梗、苦杏仁、百部、甘草等12种中药组方，有清宣肺气、止咳化痰功效，临床主要用于外感咳嗽的治疗[1]。现行质量标准为原国家食品药品监督管理局标准，该标准在定性鉴别之外，仅对苦杏仁中的苦杏仁苷进行了含量控制[1]。方中浙贝母有清热化痰、润肺止咳功效，贝母素甲和贝母素乙为其主要活性成分[2-3]。本研究中采用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法测定两成分含量，为完善该药品质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括1260 Infinity蒸发光散射检测器（美国Agilent公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q Intergral 3型超纯水机（美国Millipore公司）；SK250HP型超声波清洗仪（上海利导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

贝母素甲对照品（批号为110750-201612，纯度为96.2%），贝母素乙对照品（批号为110751-201712，纯度为97.7%），均购自中国食品药品检定研究院；杏贝止咳颗粒（江苏康缘药业股份有限公司，批号分别为170721，170906，171108，规格为每袋 4 g）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：70% 乙腈溶液 （含 0.08% 二乙胺）；流速：0.8 mL/min；ELSD 漂移管温度：85℃；载气（氮气）流速：2.1 L/min；雾化器温度：70 ℃；进样量：10 μL[4-5]。

2.2 溶液制备

称取贝母素甲、贝母素乙对照品各适量，精密称定，加甲醇制成贝母素甲和贝母素乙质量浓度分别为1.328 g/L和1.247 g/L的混合对照品贮备液，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。取样品适量，称取4.003 2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加浓氨溶液5 mL，浸润2 h，加氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（1∶7∶2，V/V/V）混合溶液 70 mL，置80℃水浴上加热回流2 h，放冷，滤过；残渣以混合溶液溶解，滤过，合并滤液，置100 mL容量瓶中，加混合溶液定容。精密量取续滤液50 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按杏贝止咳颗粒处方和工艺制备缺贝母的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取上述溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果阴性对照品溶液色谱在与贝母素甲和贝母素乙对照品溶液色谱相同保留时间处无干扰峰，说明本试验专属性良好。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取混合对照品贮备液2.0，1.0，0.5，0.2，0.1 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制得系列混合对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测对照品进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得贝母素甲和贝母素乙回归方程分别为Y甲=1.468 5X甲+5.901 4，r=0.999 9（n=5），Y乙=1.469 3X乙+6.225 7，r=0.999 7（n=5）。结果表明，贝母素甲和贝母素乙进样量分别在0.133～2.655 μg和 0.125～2.547 μg范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限测定：分别精密量取混合对照品溶液适量，倍比稀释，按拟订色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）为10∶1和3∶1分别计算定量限和检测限。结果贝母素甲和贝母素乙定量限分别为0.132 8 μg和0.124 7 μg，检测限分别为 0.044 26 μg 和 0.062 35 μg。

精密度试验：取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件进样，连续测定6次，记录峰面积。结果贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为0.91%和1.09%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（批号为170721）适量，分别于室温下放置 0，1，3，5，8，12 h 时进样，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为1.23%和1.42%（n=6），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

重复性试验：称取样品（批号为170721）适量，精密称定，共6份，同法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果贝母素甲和贝母素乙平均含量分别为每袋0.892 4 mg和1.172 6 mg，RSD分别为1.12%和1.12%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的样品（批号为170721）适量，每份 2.0 g，共 9 份，按 80% ，100% ，120%水平分别加入混合对照品贮备液，同法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

取样品各适量，同法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标两点法计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/袋，n=6）

3 讨论

本试验中采用紫外-可见分光光度仪对对照品溶液进行全波长扫描，贝母素甲和贝母素乙均无强发色基团，紫外吸收很弱且为末端吸收，基线不稳，背景干扰严重。而ELSD适用于无紫外吸收化合物的定量定性分析，基线平稳，灵敏度较高。本试验中通过对不同比例的甲醇-水、乙腈-水及乙腈-水（含0.08%二乙胺）等流动相进行比较，结果显示，采用乙腈-水（含0.08%二乙胺）作为流动相时，基线噪音小，分离效果良好，各色谱峰无拖尾现象，且分析时间较短，保留时间适中。本试验中在参考文献[6-8]的基础上，对漂移管温度和载气流速进行优化，考察了飘移管温度为70～100℃、载气流速为1.5～2.2 L/min时待测成分的响应值，结果显示，漂移管温度为85℃、载气流速为2.1 L/min时，响应值最高，色谱峰峰形和分离度均良好，且不受杂质干扰。

本试验中对提取溶剂、提取方法和提取时间进行了优化筛选，分别以氯仿、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇（4 ∶1，V/V）、氯仿 -甲醇（4 ∶1，V/V）及氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（2∶7∶1，V/V/V）为提取溶剂进行试验，结果显示，氯仿-甲醇（4∶1，V/V）和氯仿-乙酸乙酯-甲醇（2 ∶7 ∶1，V/V/V）2 种提取溶剂提取效果较好，考虑乙酸乙酯的毒性低于氯仿，故选用后者；比较了超声、加热回流提取2种方法的提取效果[7]，结果显示，加热回流提取时2种待测成分含量较高；比较了提取1，1.5，2，2.5，3 h时的提取效果，结果显示，提取2 h后待测成分含量无明显变化，故选择加热回流提取2 h；选用了50，60，70，80，90 mL 的氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（2∶7 ∶1，V/V/V）混合溶液进行加热回流提取，结果显示，溶液量70 mL以上待测成分含量无明显变化，故选择70 mL混合溶液。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性好，可用于杏贝止咳颗粒贝母素甲和贝母素乙的含量测定。