陈彦彪 ，唐 骢 ，余楚钦 ，魏嘉宝 ，杨 凡 ，李苑新 △

（1.广州纳丽生物科技有限公司，广东 广州 511440； 2.广东药科大学，广东 广州 510006）

氨甲环酸又名传明酸、止血环酸和凝血酸等，其退黑祛斑功效是果酸的10倍、维生素C的50倍[1]。临床研究表明，口服或外用氨甲环酸有助于治疗黄褐斑，且不良反应小，可单用或联合其他药物使用[2]。微针是指长度在几十微米至几毫米、尖端直径几十微米的微型针头[3]，能刺破皮肤表面的角质层，极大地提高药物经皮输送效率[4]，可实现无痛、小创伤经皮给药。为增强氨甲环酸的透皮吸收，提高其疗效，本研究中采用改良Franz扩散池和高效液相色谱（HPLC）法，以离体猪皮为渗透屏障，考察实心微针、空心微针作用于猪皮对氨甲环酸注射液透皮吸收的影响，为其在美容方面的应用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型HPLC仪（美国Agilent公司）；YBP6型智能透皮试验仪（天津药典标准仪器制造厂）；超纳微晶美肤仪及其配套实心、空心微针（广州纳丽生物科技有限公司）；DW-86W100型卧式超低温保存箱（青岛海尔特种仪器有限公司）；KDC-140HR型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-500M型超声清洗机（东莞市科桥超声波设备有限公司）。

1.2 试药

氨甲环酸注射液（贵州圣济堂制药有限公司，批号为20170401，规格为每支0.5 g∶5 mL）；氨甲环酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为9Z1W-ETCD，纯度为99.9%）；甲醇、磷酸为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.3 动物

广西巴马小型乳猪，3月龄，体质量约为20 kg，广州南方医大实验动物科技发展有限公司提供，动物生产合格证号为SCXK（粤）2016-0041，批号为2017-0416。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex ODS柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.23%十二烷基硫酸钠溶液（称取磷酸二氢钠18.3 g，加水800 mL溶解，加三乙胺8.3 mL混匀，加十二烷基硫酸钠2.3 g，振摇使溶解，用磷酸调pH至2.5，加水定容至 1 000 mL，摇匀）-甲醇（60 ∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL[5]。

2.1.2 溶液制备

称取氨甲环酸对照品适量，精密称定，加水溶解，制成质量浓度为5 mg/mL的对照品溶液；取氨甲环酸注射液适量（约相当于氨甲环酸0.5 g），置100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，作为供试品溶液；以0.9%氯化钠溶液作为空白对照溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：分别取上述溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。理论板数以氨甲环酸峰计大于5 000，各成分基线分离良好，分离度大于1.5。

线性关系考察：称取氨甲环酸对照品适量，精密称定，加水溶解，制成质量浓度为8 g/L的对照品溶液，加水稀释，制得质量浓度分别为 0.1，0.5，1.0，2.0，4.0 g/L的系列对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、氨甲环酸质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=429.44X+11.413，r=0.999 9（n=5）。结果表明，氨甲环酸质量浓度在0.1～8.0 g/L范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

精密度、稳定性、加样回收试验：按规定进行试验，结果的RSD均小于1%，表明仪器精密度良好，供试品溶液在室温放置24 h稳定，本方法重复性良好，平均加样回收率为98.83%，RSD为2.35%（n=6）。

2.3 透皮试验

2.3.1 猪皮样品制备

将巴马小型乳猪放血处死，观察有无皮肤红肿、充血、破损等现象。剃毛取腹部猪皮，除去皮下组织，用0.9%氯化钠溶液洗净，置-70℃冰箱中冷冻，备用[6]。

2.3.2 分组及试验

取猪皮样品，常温解冻，切成所需小块，用0.9%氯化钠溶液洗净，用滤纸吸干水分，称定质量后摊平，表皮角质层向上。试验分为3组，即实心微针组（A组）、空心微针组（B组）、空白对照组（C组）。A组用超纳微晶美肤仪及其配套的方形实心微针，以2～3 N力垂直表面持续注入0.3 mL氨甲环酸注射液60 s。B组使用超纳微晶美肤仪及其配套的方形空心微针，同法操作。C组不作任何处理。分别将3组猪皮固定在Franz扩散池，表皮角质层朝上，下表面接触扩散池液面[7-8]。在接收池中加满0.9%氯化钠溶液37±0.1℃水浴加热，定速磁力搅拌300±5 r/min平衡1 h，向供给室加入0.3 mL氨甲环酸注射液，用密封胶封口，以防溶剂蒸发。分别于0.5，1，2，4，8，12 h 时移取接收液 1.0 mL，经 0.22 μm微孔滤膜滤过，随即补回1.0 mL备用接收液，测定含量，计算各时间点的药物累积透过量并对时间进行回归，所得斜率为透皮速率。详见图2和表1。透皮试验12 h后拆除扩散池装置，取出3组猪皮，剪取，用适量甲醇浸泡，超声（功率为500 W，频率为40 kHz）处理30 min，1 000 r/min离心15 min，补足减失的甲醇，摇匀，取适量，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，测定含量，并计算药物滞留量。详见表2。

图2 不同微针作用于猪皮时药物透皮吸收结果（n=6）

表1 药物累积透过量回归方程及透皮速率（n=6）

表2 3组药物累积透过量与药物滞留量（n=6）

结果显示，透皮试验0.5～2.0 h B组的药物累积透过量明显大于A组和C组，表明空心微针作用于猪皮可促进氨甲环酸的体外透皮作用。2.0 h后，3组药物累积透过量随时间延长而增大，表明两种微针作用于猪皮均有利于氨甲环酸的透皮吸收。3组药物累积透过量回归方程均符合零级模型。0.5 h时，A组和B组药物滞留量比C组分别提高了82.98%和162.07%；12 h时，各组药物滞留量接近，A组和B组透皮速率比C组分别提高了21.20%和37.08%。

3 讨论

本研究中选用与人体皮肤较接近的小型乳猪皮作为试验屏障，预试验中考察了腹部、背部和臀部猪皮的透皮吸收差异，发现腹部猪皮更适用于氨甲环酸透皮试验。

氨甲环酸治疗黄褐斑已逾30年，其在化学结构上与酪氨酸相似，均有1个羧基（-COOH），可与酪氨酸争夺酪氨酸酶，进而干扰酪氨酸酶对酪氨酸的激活作用，从而减少黑色素合成[9]。

微针的主要作用为刺破皮肤表面的角质层以促进药物渗透，本研究结果显示，空心微针和实心微针均有利于氨甲环酸的透皮吸收，该结果可为下一步临床研究提供依据。