朱跃芳 ，姚亮元 ，林 芳 ，陈珉珉 ，朱 婧

（1.湖南省株洲市食品药品检验所，湖南 株洲 412008； 2.湖南千金湘江药业股份有限公司，湖南 株洲 412000）

富马酸替诺福韦二吡呋酯是一种核苷酸类抗病毒药[1]，具有抗人类免疫缺陷病毒（HIV）和抗乙型肝炎（简称“乙肝”）病毒（HBV）活性[2-3]。2001 年经美国食品药物管理局（FDA）批准用于治疗HIV-1感染；2008年4月和8月，欧盟和美国FDA又分别批准其用于治疗乙肝[4-6]。由于其疗效确切，适用性好，也是多个治疗指南推荐使用的一线抗HIV和抗HBV药物[7-8]。目前，我国关于富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药有关物质测定的文献报道尚少，有的检测已知结构杂质数量也偏少[9-11]。本研究中采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定其原料药有关物质含量，为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型HPLC仪，包括二极管阵列检测器（日本Shimadzu公司）；AB135-S型电子分析天平、FE-20型pH计（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药（上海阳帆医药科技有限公司，批号分别为 120919，120920，120925，湖南千金湘江药业股份有限公司，批号分别为20130701，20130702，20130703，20170201）；替诺福韦（杂质 B）对照品（批号为100614JZ）、腺嘌呤（杂质C）对照品（批号为20120408）、替诺福韦单吡呋酯（杂质D）对照品（批号为121022），替诺福韦单吡呋单异丙酯（杂质E）对照品（批号为121128-1）、替诺福韦单吡呋单乙氧基羰氧基甲脂（杂质F）对照品（批号为130322），均购自上海阳帆医药科技有限公司；6-异丙氧甲酰胺替诺福韦二吡呋酯（杂质 G）对照品（批号为03-MAR-16-16）、替诺福韦二吡呋酯二聚体（杂质H）对照品（批号为12-JUN-16-15）均为美国QCC标准品；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Polar-phenyl C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：以 0.05 mol/L醋酸铵缓冲液（用冰醋酸调 pH 至 4.6）-乙腈（97 ∶3，V/V）为流动相 A，以0.05 mol/L醋酸铵缓冲液（用冰醋酸调pH至4.6）-乙腈（40 ∶60，V/V）为流动相 B，梯度洗脱（0～25 min时85%A→50%A，25～40min时50%A→0 A，40～50min时 0 A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

取杂质 B，C，D，E，F，G，H 对照品各适量，精密称定，分别置7个100 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释成每1 mL中分别含杂质B1.5 mg、杂质C1.5 mg、杂质D 10 mg、杂质 E 3 mg、杂质 F 1.5 mg、杂质 G 1.5 mg、杂质H 1.5 mg的单杂质对照品贮备液，分别精密量取各1 mL，置同一100 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，即得混合对照品溶液。取样品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成质量浓度为1.0 g/L的供试品溶液。以流动相作为空白对照溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，空白对照溶液色谱图中，在与各杂质对照品溶液色谱图相同保留时间处无干扰峰。详见图1。

线性关系考察：分别精密量取混合对照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 mL，置 5 个 10 mL 容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

定量限与检测限考察：精密量取混合对照品溶液适量，倍比稀释，按拟订色谱条件进样测定，以信噪比为10∶1分别计算定量限、检测限。结果见表1。

精密度试验：取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果见表1。

稳定性考察：取供试品溶液（批号为20130701）适量，分别置室温及 4 ℃ 下保存，于第 0，2，4，8，10，12，18，24 h时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。在室温下放置24 h时，除杂质D峰面积的RSD为5.3%外，其他杂质峰面积的RSD均小2.0%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h不稳定，在4℃下放置24 h稳定。

表1 回归方程与线性范围（n=5）

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为120919）适量，每份约10 mg，共9份，精密称定，溶解，分别加入0.5，1.0，1.5 mL混合对照品贮备液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品中有关物质含量测定

取7批样品各适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，并计算样品中有关物质含量。结果见表3。

表3 样品中有关物质含量测定结果（%，n=3）

3 讨论

取杂质 B，C，D，E，F，G，H 对照品各适量，在 200 ～400 nm波长范围内进行全波长扫描，结果显示，所有杂质对照品均在260 nm波长附近有最大吸收。杂质E与杂质F出峰时间很近，因此首先考察杂质E与杂质F间的分离情况，要求两者间分离度应大于1.5。本试验中对两组色谱条件进行了考察，第1组为甲醇-叔丁醇-0.01mol/L 磷酸氢二钠（用磷酸调 pH 至 5.5）（11∶1∶28，V/V/V）（A）-甲醇 -叔丁醇 -0.01 mol/L磷酸氢二钠（用磷酸调 pH 至 5.5）（27 ∶1 ∶12，V/V/V）（B），梯度洗脱；第2组为0.05 mol/L醋酸铵缓冲液（用冰醋酸调pH 至 4.6）-乙腈（97∶3，V/V）（A）-0.05 mol/L醋酸铵缓冲液（用冰醋酸调 pH至 4.6）-乙腈（40∶60，V/V）（B），梯度洗脱。结果在第2组色谱条件下，各杂质与主峰间分离度均大于1.5，更适合本样品分析有关物质。

稳定性试验结果显示，供试品溶液在室温下放置24 h时杂质D含量明显增加，说明供试品溶液在室温下放置24 h不稳定；供试品溶液在4℃条件下放置24 h总杂质的绝对偏差小于0.1%，说明供试品溶液在4℃下放置24 h稳定。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便，精密度、稳定性好，可用于富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药中7种有关物质含量的测定。