李菲 张雪纯 张镱山 宋宝丽

【摘要】目的 通过对苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）患者苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因突变的分析，为苯丙酮尿症的产前诊断、遗传咨询、治疗和采取干预措施提供一定的科学依据。方法 应用PCR产物直接测序法对123例PKU患者PAH基因第1～13外显子及其两侧内含子进行序列分析。结果 在123例患者的246个PAH等位基因中检测出了216个PAH基因突变位点，总检出率为87.8%（216/246），其中外显子3、6、7、10、11和12检出率相对较高。共发现59种突变，包括42种错义突变、8种剪接突变、5种无义突变、2种移码突变、2种同义突变。高频突变位点主要是p.R243Q（23.15%），p.R111X（8.33%），EX6-96A>G（7.87%），p.R413P（7.87%）、p.V1399V（6.48%）。结论 PKU患者具有明显的突变热点（R243Q、R111X、EX6-96A>G、R413P、V1399V）和突变热点区域（外显子3、6、7、10、11、12）。通过PAH基因直接测序可对大部分的PKU家系进行产前诊断。

【关键词】苯丙酮尿症;苯丙氨酸羟化酶;基因突变;产前诊断

【中图分类号】R589 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2019.2..03

苯丙酮尿症是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病[1]。主要由于苯丙氨酸羟化酶基因突变导致PAH活性降低或丧失，使苯丙氨酸不能转化为酪氨酸，导致血液中苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）浓度增高并在神经系统和血液中蓄积。PKU患者如未及时治疗，将由于过量的Phe及其代谢产物的神经毒性作用而导致严重的智力障碍、精神发育迟滞和继发性癫痫等。PKU的发病率有种族和地区差异[2-6]，我国约为1/11144[7]，且PAH基因突变具有相对突变热点及突变热点区域，因此可以通过对PKU患者进行基因诊断分析，了解各种突变的种类和分布，了解所研究的人群中PAH基因相对突变热点和突变热点区域，进而对产前诊断和治疗提供一定科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

230例PKU患者，来自郑州大学第一附属医院产前诊断中心遗传咨询门诊，其中，男123例，女107例，年龄16天～37岁。230例患者来自230个无关家庭，所有患者的父母均非近亲结婚。这230例患者治疗前血苯丙氨酸浓度Phe>480 μmol/L，平均（915.52±513.66），通过Phe负荷试验和尿蝶呤分析结合临床症状排除了四氢生物喋呤缺乏症。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩

抽取患者的外周血并用EDTAK2抗凝，-20℃储存。200名正常DNA来自实验室积累的健康无血缘关系个体。采用北京天根D315DNA分离试剂盒提取采集的抗凝外周血样品中的DNA。参照文献[2]设计PAH基因第1～13外显子的引物。常规PCR扩增条件：95℃5 min热变性，94℃变性30 s，55～62℃复性30 s，72℃延伸45 s，共30个循环，72℃延伸10 min。PCR反应在美国ABI公司Verteri梯度PCR仪上完成。PCR产物用2%琼脂糖检测。

1.2.2 DNA序列分析

采用PCR产物直接测序法对样品中DNA进行序列分析。PCR产物的纯化和DNA序列分析由上海生物工程科技有限公司应用美国ABI公司3730XL全自动DNA序列分析仪完成。所有PCR产物均采用正反向测序。

2 结 果

2.1 PAH基因突变的检出率

通过对123例PKU患者PAH基因外显子和内含子分析，在246条染色体中共检测到216个突变（表1），总检出率为87.8%。所有患者均检测到突变基因，其中93个人检测出2个突变位点，占75.6%。30个人检测出一个突变位点。

2.2 PAH基因突變种类

检测到的216个突变分属59种突变，其中错义突变42种、剪接突变8种、无义突变5种、移码突变2种、同义突变2种。

2.3 PAH基因突变分布特点

患者突变主要分布在第3，6，7，10，11，12外显子，其中第7外显子检测到的突变最多，共12次。其次为第11外显子，共9次。第12、10、3、6外显子分别为7、6、5、5次。

2.4 PAH基因高频突变位点

突变频率最高的是p.R243Q，共检测到50次，p.R111X检测到18次，EX6-96A>G检测到17次，p.R413P检测到17次，p.V1399V检测到14次。

3 讨 论

PKU是少数几种可治疗的严重单基因遗传病，而基因诊断是PKU唯一有效的产前诊断措施，可通过基因诊断对新生儿进行筛查发现PKU患者，及时治疗，可减轻患儿的病情。但PKU患儿需进行长期治疗，给家庭和社会带来沉重的经济负担及精神压力，通过基因诊断，避免生育PKU患儿是一种很好的对策。

1983年，PAH基因被成功分离、克隆[8]。PAH基因定位于染色体12q22-q24.1，由13个外显子和12个内含子组成，编码区全长90kb，编码含有452个氨基酸残基的酶单体，单体聚合成有功能的PAH，参与苯丙氨酸代谢。任何一种突变都有可能导致PAH结构的改变，从而导致苯丙氨酸羟化酶活性的改变，影响苯丙氨酸的代谢过程。迄今已经发现苯丙氨酸羟化酶基因一千余种突变（http：/ www.Pahdb.mcgil1.ca），国内报道的有100多种[9-11]。本文对123个先证者进行基因诊断，一共检测到59种突变，216个突变位点，总检出率为87.8%。应用MLPA技术，检测出123个先证者中有4种大片段缺失，包括5'UTR_E1杂合缺失，E4_E5杂合缺失，E5杂合缺失，E4_E7杂合缺失。上述结果提示PKU患者基因突变类型多样，位置多变，突变位置可发生在外显子、内含子及5'UTR、3'UTR。

现在世界各地PAH基因突变研究者都在致力寻找PAH基因的高频突变位点，以便通过产前诊断筛查出PKU患者。本文结果显示PAH基因突变有相对集中特点，高频突变位点分别是p.R243Q（23.15%），p.R111X（8.33%），EX6-96A>G（7.87%），p.R413P（7.87%）、p.V1399V（6.48%）。突变热点区域主要是外显子3（8.5%），6（8.5%），7（20.3%），10（10.2%），11（15.3%），12（11.9%），其中第7外显子检测到的突变最多为12次。参考Lee[12]等报道中国人的高频突变主要位于第7外显子的R243Q（23.15%），本文结果与之比较一致。在123个先证者中，有93个人都检测出两个突变位点，提示在PKU患者中两个突变位点的突变率较高，这可以作为鉴别诊断的辅助手段之一。与此同时，这些检测出两个突变位点的家系，如果其父母再次怀孕时，可以直接选择基因诊断突变位点来确诊胎儿是否是PKU患者，以免再次生出PKU患儿，为家庭带来不必要的麻烦。

很多学者的研究已经表明，在不同种族和地区PKU患者基因突变位点的分布具有明显差异性，因此研究PKU的分布及类型，对于开展产前诊断、遗传咨询有一定的意义。如当对PKU患者群体进行突变分析时，由本研究的实验数据，可优先选择第3、6、7、10、11和12外显子直接测序，即可筛查出约74.6%的突变，之后可以再对其他外显子测序，这样可以避免全编码区测序产生的不必要的浪费，并提高产前诊断的效率。

本研究明确了PAH基因突变的类型、分布和高频突变位点，为PAH基因突变的研究增加了一定的资料，丰富了中国人群的PAH基因突变谱。但本研究数据比较少，下一步就是扩大样本数据，进一步对样本中基因突变类型、分布与高频突变位点进行分析。通过对PAH基因突变数据的分析，可以为产前诊断、遗传咨询提供理论依据，对减低PKU的发病率，减轻患儿的病情，减少PKU患儿的出生以及提高人口整体素质具有重要意义。

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本文編辑：刘欣悦