非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指无过量饮酒史和其他明确的肝损伤因素、以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括轻度脂肪变性、非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和伴纤维化的小叶坏死性炎性反应。NASH可进展成肝硬化、门静脉高压、肝衰竭甚至肝细胞癌(HCC)[1]。目前NAFLD被认为是疾病晚期肝衰竭的主要危险因素，预计到2020年其将成为美国肝移植的首要病因[2]。NAFLD的病因尚未完全阐明，其发病机制学说已由经典的“二次打击”学说发展为“多次打击”学说。近年来，生物医学领域的研究热点细胞外囊泡(EV)引起了学者们的关注，其被认为是真核生物和原核生物细胞间通讯的有力工具[3]。

1 EV的概述

1.1 EV的定义与分类

20世纪下半叶，细胞外囊泡(EV)被认为是细胞降解时从细胞膜脱落的无关紧要的副产品。然而，近几十年的研究发现，EV是生理和病理条件下细胞间通讯的重要媒介[4]。EV是由脂质双分子层包裹的细胞衍生囊泡，直径在30～2 000 nm。按细胞起源和生物学功能分类，EV又可以分为外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体直径一般为40～120 nm，起源于内溶酶体途径、多泡体的腔内出芽以及多泡体与细胞膜的融合；微泡直径一般为50～1 000 nm，起源于细胞表面，由细胞膜向外萌芽；凋亡小体一般为500～2 000 nm，经凋亡细胞大规模的质膜泡化而成，是细胞发生凋亡时伴随的一种形式[5]。EV作为一种几乎所有细胞都可以分泌的生物囊泡状微小结构，广泛稳定地存在于多种人体体液中，包括血浆、恶性腹水、羊水、尿液和唾液等[6]。EV的内容物和膜表面成分均携带有来源细胞的信息，其数量和内容物随来源细胞的状态和接受的刺激而变化，同一种细胞在不同状态下可释放出内容物完全不同的EV[7]。然而，由于分离方法的技术有限，导致这些亚型的区分较为困难。

1.2 EV的组成

EV携带各种脂质、蛋白质、RNA和DNA，脂质组学分析显示，囊泡膜上含有丰富的胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、饱和脂肪酸、磷脂酰丝氨酸。此外，所有的EV都携带一些共同的标记蛋白，如热休克蛋白(HSP70和HSP90)、内体特异性的四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、MVB生物发生相关蛋白(Alix 和 TSG101)以及膜运输和融合蛋白(GTPases、flotillin、annexins)[8-9]。一些供体细胞的EV也含有独特的蛋白，如来自B淋巴细胞和树突状细胞的EV包含主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ分子[10]。除了蛋白质外，EV还携带大量的信使RNA(mRNA)、DNA、长链非编码RNA(IncRNA)、微RNA(microRNA)[7]。目前认为，这些EV携带的肿瘤特异性的miRNA或蛋白质可作为有临床应用前景的生物标志物，用于疾病的诊断并指导治疗，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤和急性缺血性中风、肾脏疾病、阿尔兹海默症、骨关节炎、炎症性肠病等[11]。

1.3 EV的生理功能

EV的主要生理功能是细胞间通讯。通过直接膜融合、受体介导的融合或内吞作用，EV将携带的生物活性物质传递给受体细胞，并调节受体细胞功能。由于其表面携带多种黏附蛋白，EV可提供一种专有的途径向治疗靶点运送治疗药物。此外，EV可通过其亲本细胞被修饰，在其表面表达或补充靶向部分所需的生物活性[12]。EV这种可以携带生物活性分子和定向向靶向器官传递的特性，为其成为药物载体和潜在的治疗剂提供了可行性。由免疫细胞和非免疫细胞产生的EV在免疫调节中也起着重要的作用，它们可以介导或抑制免疫反应，并诱导炎性反应、免疫性疾病和感染性疾病的病理过程。因此，EV也有可能被用作调节免疫系统的治疗剂[13]。

2 EV在NAFLD发生发展中的作用

2.1 肝脏分泌EV的特征

肝脏中的大多数细胞类型在体外条件下都可以分泌EV，包括肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞(HSC)、窦状内皮细胞(SEC)、库普弗细胞和其他免疫细胞(如巨噬细胞)[14]。蛋白质组学分析显示，从原代大鼠肝细胞衍生的EV中分离出了251种蛋白质。除四跨膜蛋白(如CD63、CD81和CD82)、脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)外，在肝细胞衍生的EV中也发现了肝细胞特异性受体的富集。肝细胞来源的EV携带参与细胞内通路和解毒的蛋白质、细胞色素的胞质蛋白和分泌蛋白(如凝固相关蛋白和载脂蛋白)。这些发现表明肝细胞来源的EV携带的蛋白质和核酸可以随细胞压力和刺激而改变，即在疾病状态下的细胞和组织相比于正常组，释放出的EV会有所不同，这使得EV有成为肝脏生物标志物的潜力[15]。EV参与了许多肝脏疾病的发生、发展，包括丙型肝炎病毒(HCV)感染、乙型肝炎病毒(HBV)感染、HCC、肝纤维化、肝硬化、NAFLD和酒精性肝病(ALD)[16]。

2.2 EV与NAFLD之炎性反应

近年来在NAFLD的发病机制研究中，EV参与细胞间应激信号转导这一作用被提出。饮食诱导的NASH小鼠血液中可检测到肝细胞衍生的EV，并且EV的数量与疾病的严重程度相关[17]。动物模型研究发现，受损肝细胞来源的外泌体通过激活非实质性细胞(如内皮细胞、HSC、巨噬细胞)参与了NAFLD的发展，如多次打击学说中血管生成、纤维化、炎性反应[17-18]。Heinrich等[19]的研究发现，喂食高脂饮食的大鼠血液中EV数量显著增加；血浆中衍生的EV可显著刺激活性氧(ROS)的产生，并诱导原代大鼠血管内皮细胞中血管细胞黏附分子1(VCAM1)表达，显示其具有促炎特性。Hirsova等[20]的实验发现，溶血性磷脂酰胆碱(LPC)模拟脂毒性诱导人类和小鼠肝细胞中EV的释放，发现这些EV能以一种死亡受体5(DR5)的信号通路激活巨噬细胞。巨噬细胞的配体依赖性激活意味着死亡受体5的配体——肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)存在于脂质处理后从肝细胞释放的EV中，并作用于巨噬细胞上的DR5；棕榈酸盐处理的肝细胞释放的EV上的TRAIL不诱导巨噬细胞凋亡，而是以受体相互作用蛋白1和核因子-κB(NF-κB)依赖性方式引起炎性反应应答，这表明脂毒性肝细胞诱导的EV具有促炎特性。实验中采用Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)抑制剂法舒地尔作用于小鼠肝细胞，显著降低了LPC诱导肝细胞释放的EV数量。这些发现表明脂毒性肝细胞释放的EV在NAFLD进展中起到促炎和纤维化的作用。

2.3 EV与NAFLD之纤维化

EV不仅具有促炎特性，它在肝脏纤维化中也起着作用。肝脏由肝细胞、肝窦内皮细胞、库普弗细胞、淋巴细胞、胆管细胞、HSC组成[21]。肝脏中的纤维化途径主要受HSC调节，其产生并由纤维化介质如结缔组织生长因子调控。Charrier等[22]的实验证明，活化的HSC包裹的EV中存在一种多功能肝素结合糖蛋白，即促纤维化结缔组织因子(CCN2)，可穿梭至其他静止或活化的HSC，肝脏在受到损伤时，以旁分泌的形式激活促纤维化作用。与此研究一致，Huang等[23]的研究发现，CCN2分子能够联合其他分子如纤连蛋白和转化生长因子-β(TGF-β)，促进活化的HSC增殖、存活、迁移、黏附和产生细胞外基质，从而促进肝纤维化途径。Koeck等[24]的研究也发现，内脏脂肪组织中的EV可通过诱导肝细胞和HSC中TGF-β途径的异常来参与NAFLD的进展。这些研究结果均表明，EV可能在NAFLD的纤维化过程中扮演了重要角色。

2.4 EV内容物与NAFLD的诊疗前景

EV中携带的物质在NAFLD的发生、发展和诊断中起着作用。Povero等[25]的体外实验研究显示，使用胆碱缺乏型L-氨基酸(CDAA)和高脂饮食构建NAFLD小鼠模型，相比于对照组，NAFLD组血液循环中的EV数量增加，且蛋白质组学分析揭示了NAFLD组与对照组之间EV蛋白组分的差别。NAFLD组血液循环中EV携带的miR-122水平显著升高，并证明了NAFLD中的miR-122主要封装在EV中，提示在NAFLD进展中肝细胞特异性miRNA通过血液循环中EV释放。肝脏是miR-122的主要来源[26]。此外，Csak等[27]发现血液循环中EV的miR-122水平升高伴随着肝脏中miR-122水平降低，肝脏中下降的miR-122水平有利于组织重构调节剂上调，且在NASH的肝脏纤维化中扮演着重要的角色。Yamada等[28]采用NAFLD的大鼠模型观测了血液循环中miR-122的水平，发现血清miR-122水平确实可用于评估早期NAFLD，并可能优于传统的临床检测肝脏情况的标志物。这些动物研究为了解EV在NAFLD中的作用奠定了基础。

Kornek等[29]首次在人类受试者中建立了免疫细胞衍生的EV的丰度与疾病严重程度、肝脏氨基转移酶的水平、活组织检查分级和NAFLD活动评分之间的相关性，也就是说可以用来自血清的免疫细胞微粒的量化来评估慢性肝病患者的肝脏炎性反应程度和特征。该研究指出，慢性丙型肝炎(CHC)患者的血液循环中CD4+CD8+T细胞来源的微粒数量明显增加，而NAFLD患者血液循环中来源于自然杀伤T细胞和巨噬细胞的微粒明显增加。另一项转录组学分析通过检测EV中的miRNA，可区分NAFLD和CHC，且揭示了可通过miRNA来区分肝脏疾病的分级和阶段[30]。

综上所述，EV参与了NAFLD发病机制中的关键部分，如炎性反应、血管生成、肝纤维化，并且其在NAFLD的诊断和治疗中的作用也很重要。

3 小结与展望

EV在NAFLD的发生、发展中发挥着重要作用。在疾病诊断方面，作为纳米级生物膜结构，EV可以很好地确保内容物和生物活性的完整性，其具有作为NAFLD生物标志物的巨大潜力。在治疗应用方面，EV因其稳定性和生物安全性可作为遗传物质或药物递送的载体，基于改变EV分泌的策略可能有助于NAFLD的治疗。此外，来源于间充质干细胞(MSC)的EV可能在一些肝脏疾病的治疗中形成新的疗法。但由于EV在生理条件下的重要作用，需要更多的研究来全面了解EV在NAFLD的生理和病理中的作用以及其在NAFLD诊断和治疗中的作用。