万品文，王 倩，万 春

(1.南阳市中心医院肝脏普外科，河南 南阳 473000；2.南阳市中心医院皮肤科，河南 南阳 473000)

结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，位居胃肠道肿瘤的第3位，好发于40～50岁的中年人[1]。结肠癌在北美、欧洲等地区的发病率较高，近年来其在中国的发病率呈不断上升的趋势。结肠癌发病部位隐匿，早期无明显症状，病情进展缓慢，大部分患者因脓血便、腹痛、贫血、消瘦等症状就诊，75%的患者在确诊时已发生转移，预后不良[2]。因此，及时诊断与治疗对提高结肠癌患者生存质量、延长生存期至关重要。白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是重要的辅助性T细胞2(helper T cell 2，Th2) 类细胞因子之一，在免疫应答过程中参与调控Th2和B细胞。IL-4也参与调控细胞增殖、分化及凋亡，在肿瘤疾病的发生、发展中发挥重要作用[3-4]。骨膜蛋白(periostin，POSTN)是一种骨黏附因子，主要由成骨细胞及其前体细胞合成，参与细胞募集和黏附过程。研究发现，POSTN在鼻咽癌、甲状腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，与恶性肿瘤的侵袭、转移过程密切相关[5-6]。故本研究通过检测结肠腺癌组织中IL-4、POSTN的表达水平，探讨其对结肠腺癌发生、发展的影响，旨在为结肠癌的诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2014年1月至2017年5月南阳市中心医院手术切除的结肠腺癌标本85例(术前未进行放射、化学治疗或免疫治疗)为研究对象。85例结肠腺癌患者中，男47例，女38例；年龄35～78(47.76±8.53)岁；根据Duke′s分期标准[7]分为：A期15例，B期30例，C期29例，D期11例；组织分化程度：高分化29例，中分化36例，低分化20例；有淋巴结转移者49例，无淋巴结转移者36例。选取同期43例结肠腺瘤组织标本作为良性对照，其中男24例，女19例；年龄33～75(47.34±7.89)岁；另取结肠腺癌癌旁正常组织45例作为对照，其中男27例，女18例；年龄36～77(46.25±8.64)岁；癌旁组织所选部位与肿瘤组织间的距离大于 5 cm，且经病理诊断证实为正常结肠黏膜组织。所有受试者签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2主要试剂与仪器苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色液(北京索莱宝科技有限公司)，Envision试剂盒、浓缩型二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂(丹麦Dako公司)，兔抗人IL-4多克隆抗体(美国CST公司)，兔抗人POSTN多克隆抗体(英国Abcam公司)，山羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术有限公司)，磷酸盐缓冲液(phosphatic buffer solution，PBS)(北京中杉金桥生物技术有限公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)，光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3组织标本处理结肠组织标本一部分立即冻存于液氮中，以备进行Western blot实验；一部分经体积分数10%甲醛固定后常规石蜡包埋，组织切片机连续切成3 μm厚度的切片，每例制作3～5张，置于60 ℃烘箱中烤片2 h，以防止脱片。

1.4HE染色观察结肠组织的病理学形态烘烤后的结肠组织切片依次用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；苏木精染细胞核5～10 s；双蒸水洗涤后，体积分数1%盐酸乙醇分化处理5～10 s；双蒸水洗涤后，伊红溶液染细胞质1～2 min；常规脱水透明；中性树胶封片后，在光学显微镜下进行常规组织病理学检测。

1.5免疫组织化学染色Envision法检测结肠组织中POSTN、IL-4蛋白表达烘烤后的结肠组织切片依次用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、PBS漂洗；于100 ℃柠檬酸缓冲液(pH=6.0)中高压修复抗原 3 min，室温下冷却，PBS洗涤；滴加体积分数3%H2O2，室温孵育10 min使内源过氧化物酶失活，PBS冲洗；滴加IL-4(稀释比150)或POSTN(稀释比1100)的一抗稀释液，室温孵育2 h；滴加Envision二抗溶液，27 ℃孵育30 min，PBS冲洗；滴加新配制的DAB溶液，显色3～10 min，显色充分后双蒸水终止显色；苏木精染核3 min后，依次用体积分数1%盐酸乙醇分化、双蒸水洗涤、饱和碳酸锂蓝化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明；中性树胶封片后，在光学显微镜下观察并拍照。同时，以PBS代替一抗稀释液作为阴性对照。

1.6免疫组织化学结果评判标准由本院2位资深的病理科医师采用双盲法阅读切片。每张切片通过高倍镜(×400)随机选择5个视野，统计每个视野中阳性细胞所占比例，每个视野计数至少200个细胞。根据每张切片中阳性细胞所占百分比进行计分，0分：阳性细胞为0；1分：0%<阳性细胞所占百分比<25%；2分：25%≤阳性细胞所占百分比<50%；3分：50%≤阳性细胞所占百分比<80%；4分：阳性细胞所占百分比≥80%；根据阳性细胞染色强度计分：淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。最终根据二者计分的乘积确定结果，阴性：0～3分，弱阳性：4～6分，中等阳性：7～9分，强阳性：10～12分。阴性和弱阳性定义为低表达，中等阳性和强阳性定义为高表达。

1.7Westernblot检测结肠组织中POSTN、IL-4蛋白表达取50 mg液氮冻存的结肠组织，充分研磨，采用常规方法提取结肠组织蛋白。取适量蛋白质样品，采用二喹啉甲酸法定量以调节浓度。将50 μg 蛋白样品和适量十二烷基硫酸钠缓冲液充分混合，煮沸10 min使蛋白变性；聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离；将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上；TBST缓冲液清洗膜后，将膜置于50 g·L-1牛血清蛋白溶液，室温封闭1 h；TBST缓冲液清洗膜后，将膜置于IL-4(稀释比 11 000)或POSTN(稀释比 11 000)的一抗稀释液中，4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜后置于相应的二抗稀释液(稀释比14 000)中，室温孵育2 h；TBST缓冲液洗膜后置于新配制的电化学发光显色液中显色，条带清晰出现后终止；用ImageScanner扫描蛋白胶片，用美国Bio-Rad公司生产的凝胶电泳图分析软件(Quantity One)分析蛋白条带灰度值。选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参蛋白。

2 结果

2.1不同结肠组织病理组织学变化结果见图1。HE染色结果显示，癌旁正常结肠组织结构完整，腺体细胞排列整齐、紧密；结肠腺瘤组织腺体细胞明显增大，排列疏松；结肠腺癌组织结构明显异常，腺体细胞排列紊乱，间隙扩大。

A：癌旁正常结肠组织；B：结肠腺瘤组织；C：结肠腺癌组织。

图1不同结肠组织HE染色结果(×200)

Fig.1HEstainingresultsofdifferentcolontissues(×200)

2.2不同结肠组织中IL-4蛋白的表达结果见图2。IL-4蛋白主要在细胞膜及细胞质表达，呈黄色或棕黄色弥漫分布。IL-4蛋白在癌旁正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠腺癌组织中低表达率分别为86.67%(39/45)、58.14%(25/43)、31.76%(27/85)，高表达率分别为13.33%(6/45)、41.86%(18/43)、68.24%(58/85)。IL-4蛋白在结肠腺癌组织、结肠腺瘤组织及癌旁正常结肠组织中的高表达率比较差异有统计学意义(χ2=36.275，P=0.000)；其中，结肠腺癌组织中IL-4蛋白高表达率显著高于结肠腺瘤组织和癌旁正常结肠组织(χ2=8.235，P=0.004；χ2=35.484，P=0.000)，结肠腺瘤组织中IL-4蛋白高表达率显著高于癌旁正常结肠组织(χ2=9.022，P=0.003)。

A：癌旁正常结肠组织；B：结肠腺瘤组织；C：结肠腺癌组织。

图2IL-4蛋白在不同结肠组织中的表达(Envision染色，×400)

Fig.2ExpressionofIL-4proteinindifferentcolontissues(Envisiondyeing，×400)

2.3不同结肠组织中POSTN的表达结果见图3。POSTN弥漫分布于细胞膜及细胞质，呈黄色或棕黄色。POSTN在癌旁正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠腺癌组织中的低表达率分别为82.22%(37/45)、44.19%(19/43)、27.06%(23/85)，高表达率分别为17.78%(8/45)、55.81%(24/43)、72.94%(62/85)。POSTN在癌旁正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠腺癌组织中的高表达率比较差异有统计学意义(χ2=36.135，P=0.000)；其中，结肠腺癌组织中POSTN高表达率高于结肠腺瘤组织，但差异无统计学意义(χ2=3.799，P=0.051)，结肠腺癌组织和结肠腺瘤组织中POSTN高表达率显著高于癌旁正常结肠组织，差异有统计学意义(χ2=36.027、13.747，P=0.000)。

A：癌旁正常结肠组织；B：结肠腺瘤组织；C：结肠腺癌组织。

图3POSTN在不同结肠组织中的表达(Envision染色，×400)

Fig.3ExpressionofPOSTNindifferentcolontissues(Envisiondyeing，×400)

2.4POSTN和IL-4蛋白表达与结肠腺癌患者临床病理特征的关系结果见表1。结肠腺癌组织中POSTN、IL-4蛋白表达与患者的Duke′s分期、分化程度、淋巴结转移情况有关(P=0.001、0.011、0.009)，与性别、肿瘤大小、大体类型无关(P=0.262、0.534、0.447)。

表1POSTN、IL-4蛋白表达与结肠腺癌患者临床病理特征的关系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofPOSTNandIL-4proteinandtheclinicopathologicalfeaturesofpatientswithcolonadenocarcinoma例(%)

2.5不同结肠组织中POSTN、IL-4蛋白相对表达量比较结果见表2和图4。结肠腺癌组织和结肠腺瘤组织中POSTN、IL-4蛋白表达水平均高于癌旁正常结肠组织(P<0.05)；结肠腺癌组织中POSTN、IL-4蛋白表达水平均高于结肠腺瘤组织(P<0.05)。

表2不同结肠组织中POSTN、IL-4蛋白相对表达量比较

组别nIL-4蛋白POSTN癌旁正常结肠组织450.183±0.0350.254±0.042结肠腺瘤组织430.296±0.027a0.582±0.122a结肠腺癌组织850.735±0.128ab0.804±0.154abF637.245281.751P0.0000.000

注：与癌旁正常结肠组织比较aP<0.05；与结肠腺瘤组织比较bP<0.05。

1：癌旁正常结肠组织；2：结肠腺瘤组织；3：结肠腺癌组织。

图4不同结肠组织中POSTN和IL-4蛋白的表达(Westernblot)

Fig.4ExpressionofPOSTNandIL-4proteinindifferentcolontissues(Westernblot)

2.6结肠腺癌组织中POSTN与IL-4表达的相关性结肠腺癌组织中POSTN与IL-4蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.496，P=0.002)。

3 讨论

随着经济水平的提高和饮食结构的变化，结肠腺癌在中国的发病率逐年上升。目前，有研究者认为，80%以上的结直肠癌是由腺瘤恶化后形成，结肠腺瘤是腺上皮异型增生而产生的良性肿瘤，临床上常认为结肠腺瘤性息肉为结肠腺癌的癌前病变[8]。有研究显示，结肠腺瘤和结肠腺癌的发病特征类似[9]。经统计分析发现，单个结肠腺瘤患者罹患结肠腺癌的风险是无腺瘤者的6倍，多个结肠腺瘤患者罹患结肠腺癌的风险是单个腺瘤者的2倍[10]。结肠腺癌的发生过程常伴随着致癌基因激活、抑癌基因失活等多类基因的突变，结肠腺瘤和腺癌间的基因改变情况基本一致，结肠腺瘤的5号和18号染色体的等位基因分别缺失20%和47%，结肠腺癌分别缺失36%和73%，由结肠腺瘤转变为结肠腺癌大概需10～15 a[11]，通常腺瘤体积越大，数目越多，绒毛量越多，患者年龄越大，癌变的可能性就越大。因此，及早诊断并在内镜下摘除结肠腺瘤对防止结肠腺癌的发生具有重要意义。

细胞因子表达失衡存在于不同类型的肿瘤中，与恶性肿瘤的复发、转移密切相关。有研究表明，大部分乳腺癌、前列腺癌或结肠癌患者血清中IL-4、IL-6和IL-8蛋白表达水平较健康者升高[12]。IL-4主要由CD4+T细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞等合成分泌，是人体重要的Th2类抑炎性细胞因子，能够调节Th1与Th2之间的免疫炎症过程。正常生理条件下，促炎性和抑炎性细胞因子处于相对平衡状态，以保证机体正常的免疫功能。当外源性或内源性刺激引起促炎性和抑炎性细胞因子平衡失调时，会导致免疫异常，肠道一直处于免疫炎症状态时，导致消化系统异常、炎性增生甚至发生恶性肿瘤等[13-14]。IL-4在结肠腺癌及其他恶性肿瘤中表达上调，具有抵抗肿瘤细胞凋亡的作用，IL-4通过促进抗凋亡因子survivin转录表达来调控抗凋亡过程[15-16]。目前，IL-4在结肠腺瘤和结肠腺癌组织中的表达情况还未见报道。本研究免疫组织化学检测结果发现，IL-4蛋白在结肠腺癌组织中的高表达率显著高于结肠腺瘤组织和癌旁正常结肠组织，IL-4蛋白在结肠腺瘤组织中的高表达率显著高于癌旁正常结肠组织，说明IL-4可能参与了结肠腺瘤及腺癌的发生、发展过程，提示检测结肠腺瘤组织中IL-4水平可能成为预测腺瘤癌变风险的指标。结肠腺癌组织中IL-4表达与患者的Duke′s分期、分化程度、淋巴结转移情况有关，说明IL-4表达与结肠腺癌的严重程度密切相关，检测结肠腺癌组织中IL-4水平可在一定程度上反映结肠腺癌患者的病情发展进程。本研究中Western blot结果也证实，结肠腺癌组织中IL-4蛋白水平显著高于结肠腺瘤组织，结肠腺瘤组织中IL-4蛋白表达水平显著高于癌旁正常结肠组织，进一步说明IL-4可能参与了结肠腺瘤及腺癌的发生、发展。

POSTN基因位于人13号染色体上，大小约为36 kb，编码2种亚型，一种为骨肉瘤亚型，编码蛋白含有836个氨基酸；一种为胎盘亚型，编码蛋白含有779个氨基酸。POSTN作为一种骨黏附因子，不仅参与成骨细胞的增殖、分化、黏附以及伸展过程，还可促进骨膜成骨前体细胞的聚集、黏附，同时也参与了间质平滑肌细胞的迁移过程，在人体多种组织中普遍表达[3]。多项研究表明，POSTN在非小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、结肠腺癌等多种癌症中呈高表达[6，17-20]。POSTN能够促进血管生成以保证肿瘤细胞的存活，在恶性肿瘤的侵袭、迁移中发挥着重要作用。有研究发现，IL-4和IL-13可促进肺成纤维细胞分泌POSTN，在支气管哮喘患者的上皮纤维化过程中POSTN处于IL-4和IL-13信号的下游[21]。另有研究发现，IL-4和POSTN在慢性鼻窦炎患者的鼻息肉中均呈高表达，且二者的表达水平呈显著正相关。本研究免疫组织化学检测结果发现，POSTN在结肠腺癌组织中的高表达率高于结肠腺瘤组织和癌旁正常结肠组织，POSTN蛋白在结肠腺瘤组织中的高表达率显著高于癌旁正常结肠组织，说明POSTN与IL-4一样，也参与了结肠腺瘤的发生、发展过程，提示检测结肠腺瘤组织中POSTN水平可在一定程度上预测结肠腺瘤癌变的风险。结肠腺癌组织中POSTN表达与患者的Duke′s分期、分化程度、淋巴结转移情况有关，表明检测结肠腺癌组织中POSTN水平能够反映结肠腺癌患者的病情严重程度。本研究中Western blot检测结果亦发现，结肠腺癌组织中POSTN表达水平显著高于结肠腺瘤组织，结肠腺瘤组织中POSTN表达水平显著高于正常结肠组织，且结肠腺癌组织中POSTN与IL-4蛋白表达水平呈显著正相关，进一步表明POSTN的高表达与结肠腺瘤及腺癌的发生、发展均有关。

综上所述，IL-4、POSTN在结肠腺癌中的表达显著高于结肠腺瘤，在结肠腺瘤中的表达显著高于癌旁正常组织，说明IL-4、POSTN的高表达与结肠腺瘤及腺癌的发生、发展均有关，检测IL-4、POSTN水平可预测腺瘤癌变的风险。然而，结肠腺癌发生、发展的机制复杂，IL-4、POSTN能否作为结肠腺癌诊断及治疗的独立因子还需深入研究。