张 震 张 毅

(郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心，郑州450052)

免疫治疗已经成为癌症治疗中最具有应用前景的一种策略，并在临床试验中展现出了较好的疗效。尤其是基因工程化T细胞能够特异且有效杀伤肿瘤细胞，为实体瘤患者的治疗带来新的希望[1]。然而，无论是传统的免疫细胞疗法还是新型的嵌合抗原受体 T 细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)及T细胞受体T细胞(T-cell receptor T cells,TCR-T)治疗，均是基于终末分化效应T细胞，使其难以在体内发挥持久的抗肿瘤效应[2]。已有研究表明，过继输注的年轻化T细胞能够在小鼠体内自我更新及分化,具有长期存活的能力，并展示出显著优于终末分化的效应T细胞的抗肿瘤能力[3-5]。这些研究提示，低分化状态的免疫细胞在临床治疗中可能更具有应用潜力。

记忆性T细胞是一群异质性的细胞亚群，在肿瘤免疫应答和免疫记忆维持中发挥重要作用[6]。由于分化程度的不同使T细胞亚群在生物学特征和抗肿瘤效应等方面存在显著差异。记忆性T细胞的分化受到多种因素如转录因子、细胞因子、代谢检查点及microRNA(miRNA)等的调控[7,8]。因此，探究T细胞分化过程及如何在体外扩增出更多年轻化、抗肿瘤能力强的免疫细胞使肿瘤患者受益是目前国内外研究的热点。本文将从记忆性T细胞的表型、功能、分化机制及临床转化应用等方面进行深入探讨，以期为免疫治疗提供新的思路。

1 记忆性T细胞的表型与特征

记忆性T细胞起源的研究基于Youngblood等[9]研究团队的成果， 他们利用小鼠感染模型证实了初始T细胞(naïve T cell,Tn)在受到病原体感染时迅速获得效应功能分化为效应T细胞(effector T cell,Teff)。大部分Teff细胞在清除病原体后凋亡，但仍存在一小部分长寿命的记忆性T细胞亚群，再次发生感染时，这群细胞能够快速增殖分化。随着记忆性T细胞分化程度的增加，其自我更新和存活能力逐渐下降[10]。根据细胞表面趋化因子受体(CCR7)和淋巴结归巢分子(CD62L)将记忆性T细胞分为中心记忆性T细胞(central memory T cell,Tcm)和效应记忆性T细胞(effector memory T cell,Tem)[11]。Tcm细胞表型为CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-，由于其高表达CCR7和CD62L分子而具有快速增殖和分化的特征，能够归巢至次级淋巴器官。Tem细胞表型为CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-，具有较强的溶细胞功能，可迁移至炎症组织中迅速发挥效应功能。Villani等[12]通过基因表达谱发现Tcm细胞高表达Eomes、TCF-1、FOXP1等早期分化相关基因，而Tem细胞高表达Tbx21、PRDM1、Granzyme等效应相关基因，提示不同记忆亚群T细胞其表型和基因表达谱具有差异性。

最近研究发现在灵长类及人类的外周血中存在一群比例较低的干细胞样T细胞(stem memory T cell,Tscm)[13]。随着Tscm细胞的发现，研究者对T细胞线性分化模式进行了深入研究：Tn-Teff-Tscm-Tcm-Tem-Teff[14]。Gattinoni等[15]采用流式细胞术对人外周血中Tscm表型进行鉴定，发现这群细胞同时具有Tn和Tcm细胞的一些共有表型，即表达CD45RO-CD45RA+CCR7+CD62L+CD95+，归巢于淋巴结。同时，Tscm细胞高表达IL-2Rβ(CD122)、IL-7Rα(CD127)、CD28和CD27等与T细胞早期分化相关的分子，低表达CD57和KLRG-1等与T细胞衰老相关的标志物[15]。Tscm细胞具有较强的自我更新能力，能够在体内发挥长期抗肿瘤效应，是免疫细胞治疗中最具有应用前景的细胞亚群。

2 记忆性T细胞的临床意义和功能

记忆性T细胞在患者外周血及肿瘤微环境中的比例与预后密切相关，能够作为提示单抗治疗及化疗等的疗效指标。在57%恶性黑色素瘤患者中发现外周血CD45RO+CD8+T细胞的比例显著低于正常水平，这群患者对PD-1单抗治疗无效，而外周血中含有较高水平记忆性T细胞的患者能够对单抗治疗有效，提高其生存期[16]。在非小细胞肺癌患者中，肿瘤组织浸润的CD45RO+CD8+T细胞比例与患者预后呈正相关[17]。Lieben等[18]报道了在恶性卵巢癌患者腹水中的巨噬细胞大量产生CXCL9，通过与其受体CXCR3结合招募Tem细胞，进一步检测外周血与腹水中Tn、Tcm、Tem和Teff细胞亚群，发现Tem细胞比例显著增加且提示患者具有较好的预后。因此，记忆性T细胞在患者肿瘤微环境中的浸润是评估其预后的重要指标之一。

不同亚群T细胞在分泌细胞因子及抗肿瘤免疫中发挥不同的作用。传统选择过继性输注的T细胞是根据其能否产生大量IFN-γ和特异性杀伤靶细胞。在体外试验中发现Tem细胞分泌IFN-γ的水平较高，其清除抗原能力强，可以作为免疫细胞治疗的亚群。但是将Tscm、Tcm和Tem细胞分别过继输注至小鼠体内后，约60%的Tscm细胞能够维持其表型，仅有30%的Tcm细胞维持其细胞表型，而Tem细胞快速进入终末分化阶段[15]。因此，Tem细胞在体内的存活能力及杀伤效果较差。Tcm细胞能够引起肿瘤的消退，其体内杀伤功能显著优于Tem细胞。Tscm细胞分泌IL-2的水平较高、具有干性和分化为其他记忆亚群的特性，使其在淋巴结和非淋巴组织中均具有较强的增殖能力，并在小鼠体内长期存活。Nicoletta等[19]报道了通过体外分选健康供者Tn 细胞，采用 CD3/CD28 beads 活化后加入 IL-7 和 IL-15 等细胞因子进行培养，能够诱导产生大量表达 CD45RA、CD95、CCR7和CD62L 的Tscm细胞。同时将体外诱导的各亚群T细胞输注至免疫缺陷小鼠体内，发现Tscm细胞能够显著延长小鼠生存期。这些结果说明Tscm细胞抗肿瘤活性及体内生存能力均优于其他亚群。

3 调控记忆性T细胞分化的机制

免疫治疗成功的一个关键因素是获得免疫记忆性，即输注的T细胞亚群能够在体内维持自我更新和分化，从而有效杀伤肿瘤细胞。已有文献报道在Tn细胞分化为记忆性T细胞的过程中具有可塑性并受到多种因素的调控。因此，明确影响T细胞分化的机制，对体外获得更多年轻状态T细胞并用于免疫细胞治疗非常重要。以下，我们将重点逐一分析转录因子、细胞因子、代谢检查点和miRNA等在调控记忆性T细胞分化中的作用。

3.1转录因子 随着二代测序技术的普及，T细胞分化过程中重要的转录因子逐渐被发现，它们在调控记忆性或效应性T细胞相关基因表达中发挥重要作用。在记忆性T细胞分化为Teff的过程中，多种转录因子如脱中胚蛋白(Eomesodermin,Eomes)、T细胞转录因子(T cell factor-1,TCF-1)、淋巴增强转录因子(Lymphoid enhancer-binding factor-1,LEF-1)及人runt相关转录因子3(human runt-related transcription factor 3,Runx3)的表达逐渐下降，而T-bet及B 淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein 1,Blimp-1)的表达水平增加[20,21]。其中Eomes和T-bet能够调节T细胞发育和自稳态平衡[22]。T-bet属于T-box家族成员，主要功能是通过上调KLRG-1的表达促进T细胞向终末状态分化。小鼠实验发现IL-12能够诱导T-bet的表达，产生一群表型为IL-7RloKLRG-1hi的终末分化前体细胞。敲除小鼠T-bet基因后，可诱导T细胞高表达IL-7R并向记忆前体细胞分化[23]。Knudson等[24]报道了Eomes 在记忆性T细胞上高表达且是Tcm细胞表型维持的关键因子。进一步研究发现，采用NF-κB抑制剂处理T细胞后降低了Eomes的表达水平，说明NF-κB通路活性能够维持记忆性T细胞Eomes的表达。有研究发现，TCF-1和LEF-1在记忆性T细胞高表达，能够维持其自我更新能力，且淋巴结中TCF-1表达水平显著高于其他组织，表明TCF-1是记忆性T细胞的特征性标志物[25]。Runx家族的3个成员Runx1、Runx2和Runx3是调控T细胞发育的重要转录因子[26]。其中，在Runx3敲除小鼠模型中发现外周CD8+T细胞比例显著下降，其增殖能力也降低。此外，Runx3能够调控组织记忆性CD8+T细胞的分化与自稳态[27]。在恶性黑色瘤小鼠模型中输注高表达Runx3的T细胞能够减缓肿瘤生长，延长小鼠生存期。因此，记忆性T细胞的分化受到多种转录因子的调控，然而不同转录因子之间的相互作用有待进一步研究。

3.2细胞因子 大量文献表明，在免疫细胞培养体系中添加不同细胞因子可使其向记忆性或效应性T细胞分化。已有研究证实IL-2诱导T细胞向Teff分化，而IL-7、IL-15及IL-21等能够诱导记忆性T细胞分化[28]。IL-7属于促红细胞生成素家族Ⅰ型短链细胞因子，主要在适应性免疫中发挥作用。IL-7与其受体 IL-7R 结合后对T细胞的稳态及记忆性维持方面的功能已经较明确，但相关机制仍需进一步探究[29]。IL-15 能够诱导 T 细胞的活化、延长其生存时间。同时，IL-15诱导产生具有高亲和性的抗原特异性T细胞并维持其记忆性。IL-15与其受体 IL-15R 结合后激活免疫细胞 STAT3 和 STAT5 通路,并招募下游 PI3K 或 AKT 的活化，从而促进T细胞的增殖[30]。在体外，IL-7和IL-15联合诱导产生Tscm细胞，为过继细胞免疫治疗提供具有较强抗肿瘤活性的细胞亚群。IL-21与IL-15结构相似，通过诱导早期分化的表型对 Tcm 细胞的维持和发育起到重要作用。同时，IL-21诱导的记忆性细胞与CTLA-4单抗联合后可以应用于临床患者的治疗[31]。目前，采用小分子化合物如TWS119及雷帕霉素等能够在体外诱导记忆性T细胞。在我们的研究中，使用了IL-7、IL-15或IL-21与TWS119联合培养免疫细胞，采用流式细胞术检测细胞记忆表型发现IL-7+IL-21+TWS119组合显著促进Tscm和Tcm细胞形成，并降低PD-1和Tim-3的表达水平。与单独TWS119或联合其他细胞因子组相比较，IL-7和IL-21增强了CD8+T细胞分泌促炎性细胞因子的能力并抑制了T细胞的凋亡。然而，采用细胞因子与药物联合促进记忆性T细胞分化的机制仍有待研究。

3.3代谢检查点 T细胞在分化过程中发生了代谢重编程，即Tn细胞由于能量需求低主要通过氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)获得ATP。Teff细胞处于活化状态主要通过糖酵解(Glycolysis)方式获得营养物质使T细胞快速增殖、清除肿瘤细胞。Teff细胞分化为记忆性T细胞后其线粒体呼吸增加，转化为脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO)和氧化磷酸化[32]。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过竞争性利用糖酵解抑制T细胞的代谢重编程，使记忆性T细胞形成受到抑制。越来越多的证据表明了代谢对T细胞分化影响的重要性，发现T细胞代谢受到检查点AMPK、mTOR、Myc 和 HIF-1α的调控[8,33-35]。AMPK是结构上高度保守的苏氨酸/丝氨酸激酶的异源三聚体复合物，影响胞内AMP 和ATP 的水平。当AMP/ATP升高时，激活AMPK从而降低T细胞糖酵解水平、增加其氧化磷酸化水平[36]。二甲双胍作为AMPK的激活剂能够显著抑制肿瘤细胞生长、提高患者的生存期[37]。Eikawa等[38]报道了服用二甲双胍的小鼠移植瘤模型中肿瘤生长受到抑制，同时发现肿瘤浸润性T细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)数目增加、耗竭性表面标志物表达水平下调，从而促进记忆性T细胞产生并增强其杀伤肿瘤的能力。因而，二甲双胍能够影响体内记忆性T细胞分化，为优化培养体系提供较好的策略。mTOR、Myc和HIF-1α主要调控T细胞的糖酵解，促进Teff分化。已有文献报道采用mTOR抑制剂雷帕霉素处理T细胞后促进Tscm的产生，降低2-NBDG的表达水平，使T细胞糖酵解受到抑制。相反的，mTOR的活化能够促进myc和HIF-1α的表达，进一步上调糖酵解相关基因Glut-1和限速酶HK2的表达，从而使T细胞糖酵解水平增加，影响记忆性T细胞的分化[39]。我们的研究发现，抑制Glut-1的表达可增加T细胞的氧化磷酸化水平，同时促进Tcm细胞形成[40]。因此，靶向代谢检查点可以使T细胞向记忆性分化，为免疫治疗提供更多年轻状态的T细胞。

3.4miRNA miRNA 是一类内源性平均长度约为18～24个核苷酸的非编码小分子 RNA，在基因翻译后修饰调控中发挥重要作用。研究表明在 T 细胞中敲低miRNA成熟密切相关的 Dicer 酶的表达能够影响 T 细胞活化与增殖，提示 miRNA 对 T 细胞分化至关重要[41-43]。miRNA的表达谱随着记忆性 T 细胞形成发生了显著变化。在我们的报道中，采用荧光定量PCR检测了Tn、Teff和记忆性T细胞(Tm)上34种miRNA的表达，通过筛选发现miR-143在Tn和Tcm细胞中高表达，而在Teff细胞中低表达。进一步研究发现，miR-143通过靶向Glut-1抑制其表达，从而降低T细胞糖酵解水平，促进Tcm的形成。同时，我们检测发现miR-143在食管癌患者肿瘤组织中表达水平显著低于癌旁组织，而Glut-1在癌组织中显著高表达。通过分析肿瘤微环境中免疫抑制因素，我们发现IDO能够抑制miR-143的表达，使肿瘤组织中浸润的记忆性T细胞比例减少。然而，IDO如何通过调控miR-143表达进而影响患者体内记忆性T细胞形成还有待进一步研究[40]。此外，有文献报道miR-28能够降低肿瘤微环境中耗竭性标志物PD-1的表达并改善T细胞功能，提示miR-28在逆转耗竭性T细胞分化为记忆性T细胞方面具有重要作用，但其具体机制尚不清楚[44]。同时，有研究表明miR-17-92家族成员通过调控PI3K-AKT-mTOR信号通路促进效应T细胞分化。在小鼠模型中通过敲除miR-17-92家族能够促进记忆性T细胞的分化[45,46]。此外，多种miRNA如miR-21、miR-23 及miR-155等参与调控T细胞的功能获得与分化[43]。因此，miRNA能够通过调控基因表达及信号通路活性影响T细胞分化，为免疫治疗提供新的靶点。

4 记忆性T细胞与免疫治疗的关系

以靶向 CD19 为代表性的 CAR-T 细胞治疗儿童及成人复发难治性急性淋巴细胞白血病的完全缓解率(Complete remission,CR)可达 90%以上[47,48]。基于CAR-T细胞在血液系统肿瘤治疗中取得的良好疗效及大量临床试验的安全评估，美国 FDA 已于 2017 年批准 Kymriah 和 Yescarta 两种类型的 CAR-T 细胞作为药物上市。CAR-T细胞在血液系统肿瘤治疗中获得成功的关键因素之一是患者体内能够形成记忆性T细胞。Sabatino等[49]的研究团队在体外培养过程中获得了大量临床级别的干细胞样CAR-T细胞，主要是采用TWS119联合IL-7和IL-21等细胞因子的培养体系扩增出表型为CD8+CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD95+的CAR-T细胞。在小鼠白血病移植瘤模型中，输注干细胞样CAR-T细胞能够发挥持久的抗肿瘤效应。Ghassemi等[50]通过收集第3天～第5天和第9天的CAR-T细胞，比较其分化状态及抗肿瘤活性，发现缩短CAR-T细胞培养时间可以获得较多低分化状态的细胞亚群，在体内具有较强的抗肿瘤活性。然而，CAR-T细胞在治疗实体瘤方面进展缓慢，接受靶向表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的 CAR-T 细胞治疗后，仅 18.18% 的晚期肺癌患者出现部分缓解，其余患者均无反应[51]。TCR-T细胞在实体瘤治疗中具有较好的临床应用前景，但是由于肿瘤微环境的免疫抑制作用及体外经TCR基因转染的T细胞处于终末分化状态等使很多患者无法受益[52]。因此，体外通过采用细胞因子及小分子化合物TWS119等方案诱导Tscm亚群或通过靶向代谢检查点获得大量Tcm细胞亚群是目前提高免疫治疗疗效的有效手段。同时，将抗原特异性TCR基因或者CAR载体转染至Tscm或Tcm亚群，获得能够在体内发挥持久抗肿瘤效应的基因工程化T细胞并输注给患者也会为细胞免疫治疗带来更好的效果(图1)。一项临床试验研究发现，基因改造后的Tscm在体内存活长达12年，并具有良好的安全性和功能[53]。综上所述，Tscm和Tcm细胞亚群在临床抗肿瘤免疫治疗中具有较好的临床应用前景，可以为改善患者预后提供个性化的治疗方案。

图1 记忆性T细胞亚群在肿瘤免疫治疗中的作用

5 总结与展望

免疫治疗已经成为肿瘤治疗的重要手段，而获得具有免疫记忆性的T细胞能够增强治疗的持久性和有效性。不同亚群记忆性T细胞可根据其表面标志物、基因表达谱及代谢方式等进行鉴定。在临床前试验中已经证实体内记忆性T细胞的形成可以显著抑制小鼠肿瘤生长，延长其生存期。同时，通过体外诱导培养可获得临床级别的记忆性T细胞。但仍存在许多问题需要解决：(1)阐明维持记忆性T细胞表型的相关分子机制及表观遗传修饰的影响；(2)部分患者由于免疫状态低下难以获得足够数量的免疫细胞进行诱导培养；(3)输注的免疫细胞易受到微环境的抑制难以发挥抗肿瘤效应。如何清除肿瘤微环境中的抑制因素如髓源性抑制细胞(MDSC)、巨噬细胞(Macrophage)及调节性T细胞(Treg)等，使记忆性T细胞能够达到肿瘤部位并杀伤肿瘤细胞是目前值得关注的重要科学问题。同时，值得注意的是单一的治疗方式并不能有效清除肿瘤细胞，应将免疫细胞治疗与PD-1单抗、CTLA-4单抗或放、化疗等治疗方式相结合，从而使患者获得更好的疗效。综上所述，记忆性T细胞显示了优越的临床应用潜能，我们坚信其会在未来的免疫治疗中发挥重要作用。