张 旭，张 海，周碧君* ，王开功，文 明，程振涛，罗引幸，刘丽娟，丁尊俄，赵大杰

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳550025;2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵阳550025;3.贵阳市动物疫病预防控制中心，贵阳550081)

牛乳头状瘤(bovine papillomatosis，BP)是由牛乳头状病毒(bovine papillomavirus，BPV)引起牛体表或黏膜的肿瘤性疾病，可引起良性和恶性肿瘤［1－2］。良性肿瘤在一般情况下可自行消退，但当环境因素和遗传因素协同作用时会导致恶性肿瘤，导致牛死亡［3－4］。在集约化饲养场牛乳头状瘤十分普遍，其发病率较高，到目前为止依旧没有有效的的疫苗来预防牛乳头状瘤病的发生［5］，在一定程度上造成了较大的经济损失。

BPV为无囊膜病毒，直径为55～60 nm的正二十面体，其遗传物质的长度约为7000～8000 bp双链闭环DNA分子［6］。BPV基因组含有3个区域:早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非编码区(NCR)［7］，L区编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。BPV L1基因编码的衣壳蛋白暴露在病毒粒子表面，可能与病毒感染及免疫有关［8］;研究表明BPV L1蛋白具有B细胞特异性抗原表位，可诱导机体产生中和性抗体，激发保护性免疫，是进行预防免疫的主要抗原［9－10］。因此，BPV L1 蛋白是研制预防性疫苗的候选基因，也是临床上诊断BPV理想抗原［11］，对牛乳头状瘤的诊断方法的建立具有重要价值。本试验通过对BPV1贵州株(BPV1－GZLZ株)L1基因进行克隆、测序分析、构建重组质粒pCold－BPV1－L1，并进行IPTG诱导表达L1重组蛋白，经 SDS－PAGE和 Western blotting分析，为BPV1诊断试剂和基因工程疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 牛乳头状瘤病毒1型贵州株(BPV1－GZLZ株)、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21感受态细胞、pColdⅠ原核表达载体均由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存;Eco RⅠ、XhoⅠ、异丙基硫基半乳糖苷购自宝生物工程(大连)有限公司;兔源BPV1 L1多克隆抗体由贵州省动物生物制品工程技术研究中心制备;2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、DNA 提取试剂盒、His单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自上海生物工程公司;Tween－20、PVDF膜购自北京索莱宝科技有限公司，其他均为分析纯化。

1.2 引物设计与合成 根据 GenBank公布的BPV1 L1基因序列，设计特异性引物，上游引物P1:5＇－CCGCTCGAGATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTG－3＇;下游引物 P2:5＇－CGGAATTCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGG－3＇;预期扩增片段长1488 bp，引物由上海英潍捷基公司合成。

1.3 目的片段扩增及纯化 采用DNA提取试剂盒对病料组织总DNA进行提取，以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系50μL:上、下游引物(10μmol/L)各2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，模板2 μL，灭菌双蒸水19μL。PCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃变性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，35个循环;72℃终延伸10 min。扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 BPV1－GZLZ株L1基因克隆及序列分析 回收纯化目的DNA并连接至pMD19－T载体上，再转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含氨苄青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板筛选阳性重组子。提取质粒，进行PCR鉴定。将产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD19－T－L1，送往赛默飞世尔科技(中国)有限公司测序。利用DNAStar、Mega 5.0等软件对BPV1－GZLZ株与国内外主要的BPV参考毒株(表1)的核苷酸及其推导的氨基酸序列进行比对分析，并绘制系统进化树。

表1 GenBank中登陆的BPV参考株序列信息Tab 1 GenBank landing BPV reference strains in sequence

1.5 BPV1－GZLZ株L1基因生物信息学分析 采用在线软件 ExPASy(http://web.expasy.org/cgi－bin/protparam/protparam)分析预测编码蛋白质的理化性质及氨基酸组成。采用SPOMA在线服务器(https://npsa－prabi.ibcp.fr/cgi－bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构;采用DNAStar软件Protean程序预测B细胞表位多参数;采用NCBI服务器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.Blast)预测保守结构域;采用 TMHMM2.0 Server在线服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM－2.0/)预测跨膜结构域;采用 SignalP4.1 在线服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽。利用 SWISSMODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)在线预测蛋白质的三级结构。

1.6 原核表达载体构建

1.6.1 酶切与连接 用Eco RⅠ和 XhoⅠ对构建的质粒pMD19－T－L1和原核表达载体pColdⅠ进行双酶切，37℃水浴过夜，酶切体系为40μL:10×H Buffer 4 μL，Eco RⅠ、XhoⅠ各 2 μL，pColdⅠ/pMD19－T－L1 20μL、ddH2O 12μL。酶切后采用胶回收试剂盒进行纯化回收，将目的片段与线性pColdⅠ16℃连接过夜，连接体系为 10μL:目的片段 4μL、线性pColdⅠ 4 μL、SolutionⅠ 5 μL。

1.6.2 重组质粒转化 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含氨苄青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板筛选阳性重组子。提取质粒，进行PCR鉴定。将PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为阳性的重组质粒命名为pColdⅠ－BPV1－L1，送往赛默飞世尔科技(中国)有限公司测序。

1.7 重组蛋白诱导表达与鉴定 首先对含有阳性重组质粒的BL21表达宿主菌进行诱导，再进行温度和诱导条件的优化，按1∶100的比例接种于含氨苄青霉素抗性的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600≌0.6 左右，加入 IPTG(终浓度为 1.0 mmol/L)，同时设立无IPTG诱导对照组，37℃继续震荡培养5 h。取诱导表达菌液，离心取沉淀，用PBS洗涤一次，用 PBS悬浮沉淀，吹匀置于冰上超声破碎处理，12000 r/min 4℃离心10 min，分别收集上清和沉淀，并对上清、沉淀和无 IPTG诱导组用 5×SDS蛋白上样缓冲液沸水浴4 min制样，用12%SDSPAGE鉴定。之后对重组原核表达蛋白进行Western blotting鉴定，一抗为His－tag抗体(稀释度为1 ∶1000)，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(稀释度为1∶1000)，最后加入二氨基联苯胺(DAB)－H2O2避光显色，分析结果。

2 结果与分析

2.1 BPV1－GZLZ株L1基因PCR扩增 以提取的BPV1－GZLZ株阳性组织病料DNA为模板，进行L1基因特异性PCR扩增，经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，得到大小为1488 bp的条带，与预期结果相符，结果见图1。

2.2 测序结果 将鉴定的阳性重组质粒进行测序，测序结果采用DNAStar软件进行序列拼接，获得BPV1－GZLZ株L1基因核苷酸序列。由图2可知，L1基因核苷酸序列长为1488 bp，编码495个氨基酸。

图1 BPV1－GZLZ株L1基因PCR扩增电泳图Fig 1 Amplification of L1 gene of BPV1－GZLZ by PCR

图2 BPV1－GZLZ株L1基因测序结果Fig 2 Secquencing result of L1 gene of BPV1－GZLZ

2.2.1 BPV1－GZLZ 株 L1 基因核苷酸同源性分析将克隆的BPV1－GZLZ L1基因序列与GenBank上公布的15株牛乳头状瘤病毒14个基因型的L1基因进行核苷酸比对分析。由图3可知，BPV1－GZLZ L1基因序列与牛乳头状瘤病毒1型BPV1(登录号:X02346)的核苷酸序列同源性为99.8%，与 NCBI收录的另外两株BPV2(登录号:JQ79817)、BPV2－GZ01(登录号:KX113620)的同源性分别为82.9%、82.8%，与NCBI收录1株BPV13(登录号:JQ79817)的同源性为83.9%。

图3 BPV1－GZLZ株L1基因的核苷酸同源性分析Fig 3 Nucleotide homology analysis of L1 gene of BPV1－GZLZ

2.2.2 BPV1－GZLZ 株 L1 基因编码蛋白氨基酸同源性分析 采用DNAStar软件分析出BPV1－GZLZ L1基因的氨基酸序列，并与GenBank中公布的15株牛乳头状瘤病毒14个基因型的L1基因编码氨基酸序列作同源性分析。由图4可知，BPV1－GZLZ L1基因氨基酸序列与牛乳头状瘤病毒1型BPV1(登录号:X02346)的氨基酸序列同源性为99.8%;与NCBI收录的另外两株 BPV2(登录号:JQ79817)、BPV2－GZ01(登录号:KX113620)的同源性分别为 92.1%、91.3%，与 NCBI收录 1株 BPV13(登录号:JQ79817)的同源性为92.7%。

图4 BPV1－GZLZ株L1基因编码蛋白的氨基酸同源性分析Fig 4 Amino acid homology analysis of L1 gene of BPV1－GZLZ

2.2.3 BPV1－GZLZ 株 L1 基因系统进化树分析将BPV1－GZLZ株L1基因与国内外发表的BPV不同毒株L1基因的核苷酸序列采用DNAStar软件绘制遗传进化树。结果显示，BPV1－GZLZ株与BPV1(登录号:X02346)处在同一遗传进化分支(图5)。由图5可知，BPV1－GZLZ株与 BPV13(登录号:JQ79817)和 BPV2(登录号:JQ79817)、BPV2－GZ01(登录号:KX113620)的亲缘关系较近。

图5 BPV1－GZLZ株L1基因核苷酸序列的系统进化树Fig 5 Phylogenetic tree of L1 gene BPV1－GZLZ on nucleotide sequence

2.3 BPV1－GZLZ株L1蛋白质理化性质的分析使用ExPASy(Compute PI/MW)、ProtParam在线分析软件预测蛋白质的理化性质及氨基酸组成。L1蛋白分子质量为55.55122 ku，分子结构式为C2484H3884N678O737S16，理论等电点(PI)为 8.68。其氨基酸组成中Leu最多，占到9.1%，不含Pyl(0)和Sec(U)。在该蛋白的氨基酸中，碱性氨基酸有3种(Arg、Lys、His)，共 68 个，占 11.7%;酸性氨基酸有2 种(Asp、Glu)，共 52 个，占 10.5%;亲水性氨基酸有 6 种(Asp、Glu、His、Lys、Ser、Thr)，共 165 个，占33.33%;疏水性氨基酸 9 种(Ala、Ile、Pht、Leu、Met、Pro、Val、Trp、Tyr)，共 217 个，占 43.84%，推测 L1蛋白为碱性蛋白。L1蛋白在哺乳动物网状细胞、酵母和埃希氏大肠杆菌中表达的半衰期分别大于30 h、20 h 和10 h，在溶液中的不稳定指数为 39.38，低于阈值40，属于稳定类蛋白。

2.4 BPV1－GZLZ株L1基因B细胞表位预测

2.4.1 L1基因编码蛋白二级结构预测 采用SOPMA在线服务器预测L1基因编码蛋白的二级结构(图6)。由图6可知，BPV1－GZLZ株L1基因编码蛋白的二级结构主要包括α－螺旋、β－转角、无规则卷曲和β－折叠，所占比例分别为 21.01%、12.12%、38.59%和28.28%。在整个蛋白二级结构中无规则卷曲、β－折叠和α－螺旋区域出现相对较多，而此序列中β－转角所占比例相对较少。

2.4.2 L1基因编码蛋白B细胞多参数分析 采用DNAStar程序包中的Protean软件综合分析预测L1基因编码蛋白B细胞表位各参数。采用 Kyte－D00little法分析亲水性，Karplus－Schulz法分析柔韧性Jameson－Wolf法分析抗原指数和Emini法分析氨基酸表面可及性进行分析，以高于阈值的氨基酸残基作为候选参考区域(图7)。由图7可知，该蛋白在整个氨基酸区域中，都具有良好的亲水性，柔韧性分布较均匀，抗原性和表面可及性较高。

2.5 BPV1－GZLZ株L1基因编码蛋白保守结构域预测 采用NCBI服务器上的CDART工具分析L1基因氨基酸序列保守结构域(图8)，由图8可知，没有发现具有明显特征的保守结构域。

图6 BPV1－GZLZ L1基因编码蛋白二级结构预测Fig 6 Secondary structure prediction of BPV1－GZLZ L1 protein

图7 BPV1－GZLZ L1蛋白B细胞表位参数预测Fig 7 B cell epitope prediction for L1 protein of BPV1－GZLZ by the DNAStar method

图8 BPV1－GZLZ L1基因编码蛋白保守结构域分析Fig 8 Conserved domain analysis of L1 protein of BPV1－GZLZ

2.6 BPV1－GZLZ株L1基因编码蛋白的跨膜结构预测 采用TMHMM2.0 Server在线服务器对L1蛋白跨膜结构域进行预测和分析(图9)。由图9可知，BPV1－GZLZ L1基因编码蛋白发现无跨膜结构域。

2.7 BPV1－GZLZ株L1基因编码蛋白信号肽预测采用SignalP4.1在线服务器对BPV1－GZLZ株L1蛋白序列中是否存在潜在的信号肽进行预测。结果显示，此蛋白无信号肽，即为非分泌蛋白(图10)。

图9 L1蛋白跨膜结构域预测Fig 9 Prediction of trans membrane domains of L1 protein

图10 L1蛋白信号肽预测Fig 10 The signal peptide analysis of L1 protein

2.8 原核表达载体构建 将克隆的质粒pMD19－TBPV1－L1与原核表达载体pCold I同时用Eco RⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，均能扩增出相应的目的条带(图11)，将回收的目的片段进行纯化回收，构建原核表达载体pColdI－BPV1－L1，将构建的质粒进行菌液PCR鉴定(图12)，送公司测序。

图11 质粒pMD19－T－BPV1－L1双酶切Fig 11 Plasmid pMD19－T－BPV1－L1 double digestion

图12 原核表达载体pCold I双酶切Fig 12 Prokaryotic expression vector pCold I double digestion

2.9 pColdI－BPV1－L1原核表达及鉴定结果 对含有阳性重组质粒 pColdI－BPV1－L1的BL21表达宿主菌进行温度和诱导表达，12%的SDS－PAGE电泳鉴定结果(图13)显示，重组表达蛋白主要以包涵体形式存在，重组蛋白分子量约为55.6 kD，与理论值一致。

图13 重组 pCold I－BPV1－L1蛋白表达产物的鉴定Fig 13 Identification of recombinant p Cold I－BPV1－L1 protein expression product

2.10 pColdI－BPV1－L1 重组原核表达蛋白的鉴定结果 Western blotting结果显示，经IPTG诱导的重组表达蛋白能与His单抗和已制备好的兔源BPV1 LI多克隆抗体产生特异性反应产生特异性反应，条带为55.6 kD左右，与SDS－PAGE结果一致，结果见图14和图15。

3 讨论与结论

牛乳头状瘤病在1929年被首次报道，现在世界各地都广泛流行并传播［12］。在我国新疆、东北和海南地区近两年也有该病的报道［13］。BPV会影响牛产奶量出现下降和皮革质量、生长性能等，严重的会导致牛死亡［14］。贵州省为快速发展养牛业，从外地引进优质牛种，牛交易过于频繁，给BPV的感染带来了巨大的潜在风险，也给该省持续健康发展的养牛业带来巨大的挑战。

图14 重组蛋白pColdI－BPV1－L1的Western blotting鉴定Fig 14 Western blotting identification of recombinant protein pColdI－BPV1－L1

图15 重组蛋白r His－L1的Western blotting鉴定Fig 15 Identification of recombinant protein r His－L1 by Western blotting

本研究应用PCR扩增、克隆测序、生物信息学分析，构建了pCold I－BPV1－L1原核表达质粒并且成功诱导表达。结果显示BPV1－GZLZ株L1基因序列全长是1488 bp，编码495个的氨基酸，分子结构式为C2484H3884N678O737S16，二级结构主要包括α－螺旋、无规则卷曲和β－折叠为主。彭昊等［15］研究结果显示，BPV－GX－LA150909与 BPV1参考株无论是基因组还是 L1基因同源性非常高，而本研究中BPV1－GZLZ L1基因序列与牛乳头状瘤病毒1型参考株BPV1的核苷酸和氨基酸同源性均为为99.8%，BPV1－GZLZ株与BPV1参考株处在同一遗传进化分支，说明 BPV1－GZLZ株与 BPV－GXLA150909株可能均来自相同的来源。本研究采用外源基因常用的大肠杆菌表达系统，与酵母、昆虫、细胞等原核表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有培养简单、成本低、生长繁殖快、表达量高等优点。实验选用了具有良好表达效果的pColdⅠ原核载体，该载体为氨苄抗性，载体带有His－tag标签，为方便进行后续的蛋白纯化实验。SDS－PAGE和Western blotting检测结果显示，重组表达蛋白主要以包涵体的形式存在，且与His单抗产生特异性反应，与预期结果相同，证明 L1基因在大肠杆菌BL21中得到了有效的表达;该蛋白具有均匀的柔韧性和良好的亲水性，其抗原性和表面可及性也较高，但能否刺激机体产生体液免疫、产生特异性抗体，还需进一步研究验证。