王 静 杜 欣 冯同富 郑 嵘 周利敏

湖北省妇幼保健院(武汉，430070)

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性恶性肿瘤，是当下唯一可早期预防和早期诊断的恶性肿瘤[1]。宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌前病变的主要疾病状态，癌前病变时及时阻断，完全清除病灶，可有效预防宫颈癌的发生，改善患者预后转归[2]。随着现代分子生物学的快速发展，学者们逐步发现生物标志物作为一种特异性物质可对宫颈癌及其癌前病变的诊断起到重要的作用[3]。P16基因是一种抑癌基因，可直接参与细胞周期调节，近年国外研究发现宫颈癌的可能机制是高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)表达的E7蛋白与视网膜母细胞瘤(p Rb)蛋白及P53结合降解失活，导致细胞周期失去抑制，细胞异常增殖恶化而出现恶性转化，从而出现P16过表达[4]。OLFM4是新近发现的抗细胞凋亡的糖蛋白，可促进肿瘤细胞生长和发展转移，准确反映宫颈上皮细胞增殖分化情况，区分正常宫颈组织和CIN[5]。但目前国内关于P16、OLFM4诊断CIN的报道较为少见，本研究探讨阴道镜活检联合两种生物标志物检测辅助CIN诊断，为宫颈癌的早期诊断、治疗和预后评估提供可靠依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年4月—2019年4月因宫颈病变于本院妇科门诊就诊，行阴道镜活检的CIN患者240例。纳入标准：①因接触性出血或异常阴道出血就诊；②有性生活史；③自愿签署本研究知情同意书。排除标准：①合并自身免疫性疾病；②近期服用过免疫抑制剂；③有宫腔手术史或放化疗史；④急性生殖道炎症。根据病理诊断结果分为CINI(98例)、CINⅡ(82例)、CINⅢ(60例)。选取同期60例因子宫良性病变切除的宫颈标本作为对照组。

1.2 阴道镜检查

于月经后3～7d行阴道镜活检，检查前48h禁止性生活、阴道冲洗、局部用药及妇科检查，仪器选择Leica MZ6光电一体数码电子阴道镜，由熟练妇科临床医生操作。先将弱酸性醋酸溶液均匀涂抹于宫颈表面定位宫颈可疑病灶，通过阴道镜观察分析图像颜色、构型、边界、血管等特征，发现肉眼难以观察到的亚临床病变及早期癌变部位，诊断参照《阴道镜诊断图谱》[6]。

1.3 P16、OLFM4检测

采用免疫组化法检测，SP试剂盒、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，P16抗体、OLFM4抗体购自美国Abcam公司，实验方法及步骤参照试剂盒说明进行。石蜡切片，HE染色，抗原修复采用高温高压修复方法，PBS冲洗3次(3min/次)，阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次(3min/次)，封闭，滴加一抗，4℃过夜，室温下复温30min，PBS冲洗3次(5min/次)，滴加二 抗，37℃15min，PBS冲洗3次(3min/次)，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，脱水，中性树胶封片，显微镜下观察结果。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知的阳性组织作阳性对照。

1.4 结果分析

P16阳性为细胞核与胞浆内出现棕色颗粒，OLFM4阳性为细胞质内出现棕色颗粒。根据阳性细胞所占比例分为：阳性细胞数＜5%为阴性(－)，5%～25%为弱阳性(＋)，25%～50%为阳性(＋＋)，＞50%为强阳性(＋＋＋)。

1.5 统计学分析

应用SPSS19.0软件处理数据，计数资料以%表示，行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴道镜检查与组织病理诊断

阴道镜活检诊断符合率CINI为91.7%、CINⅡ为90.2%，CINⅢ为96.7%。见表1。

表1 病理诊断与阴道镜检查[例(%)]

2.2 P16在不同病理宫颈组织中的表达

P16在对照组中阳性表达率为26.7%，低于CIN各 组(χ2＝36.216、57.593、69.474，P＜0.05)；在CINI、CINⅡ、CINⅢ中阳性表达率存在差异(χ2＝5.446、17.323、7.031，P＜0.05)，见表2。图1～4。

表2 P16在不同病理宫颈组织中的表达(例)

2.3 OLFM4在不同病理宫颈组织中的表达

OLFM4在对照组中阳性表达率为20.0%，低于CIN各 组(χ2＝48.065、71.579、80.000，P＜0.05)；在CINI、CINⅡ、CINⅢ中阳性表达率存在差异(χ2＝5.889、16.481，6.203，P＜0.05)，见 表3。图5～8。

表3 OLFM4在不同病理宫颈组织中的表达

图1：P16在慢性宫颈炎中的表达；图2：P16在CINI中的表达；图3：P16在CINⅡ中的表达；图4：P16在CINⅢ中的表达；图5：OLFM4在慢性宫颈炎中的表达；图6：OLFM4在CINI中的表达；图7：OLFM4在CINⅡ中的表达；图8：OLFM4在CINⅢ中的表达

3 讨论

宫颈癌的发病机制和进展过程是目前唯一明确的、可预防其发生的恶性肿瘤，多数宫颈癌并非突然发生的，而是由正常宫颈组织逐渐发展为病变组织，再发展为癌组织的过程。CIN是一种局限于上皮内的癌前病变，其进展至宫颈浸润癌理论上需要一定时间，若能在早期及时采取有效干预措施，可预防宫颈癌的发生[7]。妇科医生仅凭肉眼观察宫颈组织，极易忽略光滑、轻度糜烂及无特殊症状的宫颈，无法根据糜烂面积、程度判断病变程度及CIN级别，造成漏诊，延误病情[8]。阴道镜活检可鉴别肉眼无法观察到的宫颈病变，诊断灵敏度高，对部分炎症及临床高度怀疑病变患者具重要积极意义，可降低漏诊率[9]。本研究显示，阴道镜活检诊断CIN符合率达到90%以上，表明阴道镜活检可明显提高CIN病变的诊断率。但阴道镜活检无法取得宫颈管内的病变组织，且易受操作者临床经验影响，取材组织量少，钳夹深度不够及定位不准确限制了其对CIN及早期浸润癌诊断的价值。为了预防宫颈癌的发生发展，国内外学者正在试图寻找一种高灵敏度、高特异性的诊断方法，联合生物标记物诊断逐渐被应用于宫颈癌的早期筛查[10]。

P16是细胞周期依赖酶抑制因子，可阻止细胞从G1期发展至S期，反馈调节有丝分裂，从而发挥抑制细胞增值的作用。Mochizuki等[11]发现，P16在原发性肿瘤中表现为过表达。HPV病毒感染是宫颈病变的主要致病因素，有研究发现P16参与了HPV感染引起的宫颈病变进展，CIN中HPV的E6癌蛋白可使p Rb功能失活，丧失其对P16的负反馈调节作用，使P16过度表达，无法调节细胞周期，进一步刺激细胞不断增殖，最终导致宫颈病变[12]。国外已有研究发现[13]，P16阳性表达率越高，细胞生长抑制功能丧失越多，细胞生长和分化程度越高，进一步加重CIN病情，导致其向宫颈癌发展。本研究中，P16在对照组中阳性表达率低于CIN各组，在CINI中CINⅢ阳性表达率最高，这可能是因为CIN患者宫颈上皮细胞不典型增生破坏了细胞正常周期及状态，从而导致细胞增殖加快，加重病情进展。P16表达随CIN病变程度增加而逐渐升高，可将其作为评价患者疾病分级的辅助指标。

OLFM4是一种可促进肿瘤细胞生长的新型抗凋亡蛋白，Jang等[14]研究发现，OLFM4可参与凝集素及钙粘素的相互作用，对肿瘤细胞的黏附和转移能力有重要影响。进一步研究发现[15]，OLFM4高表达可作用于DNA合成的S期、G2/M期，加快细胞周期进程，促进肿瘤细胞增殖；OLFM4也可作用于PI3K/PKB下游，促进肿瘤细胞生长。本研究中，OLFM4在对照组中阳性表达率低于CIN各组，且CINⅢ阳性表达率最高，表明OLFM4可较为准确地区分正常宫颈组织和CIN组织，反映宫颈细胞增殖和分化情况，与宫颈癌的发生发展有关。

综上所述，阴道镜活检联合P16、OLFM4检测可对CIN早期进行有效筛查和诊断，及时提供个性化诊疗方案干预进而减少宫颈癌的发生。