吕 辉 杨晓霞 韦启鹏

湖北文理学院附属医院，湖北省襄阳市中心医院(441021)

卵巢颗粒细胞在卵泡生长发育中起重要作用[1]。颗粒细胞的分化受多种生长因子与激素影响。颗粒细胞表面存在多种特异性受体，如卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素生长因子(IGFs)受体，可影响颗粒细胞增殖分化过程[2]。其中FSH可调节颗粒细胞基因表达过程，从而诱导细胞骨架蛋白重排，颗粒细胞形态发生改变[3]。细胞骨架是维持细胞形态的重要支架[4]。其稳定性由微管相关蛋白与微管蛋白共同调节作用。有研究发现微管相关蛋白tau存在于男性精子中，可能参与精子发育过程[5]。但tau蛋白在卵巢内表达的相关报道不多。本研究通过观察tau蛋白在经FSH处理后的不同年龄小鼠卵巢颗粒细胞中表达水平及定位，探究tau蛋白在卵巢颗粒细胞中的存在及相关生物学功能。

1 材料方法

1.1 实验动物

选择出生6周成年雌性小鼠6只(成年组)及未成年雌性小鼠6只(未成年组)(湖北省实验动物研究中心)，两组小鼠均室温20℃饲养，体重成年组(25.5±0.2)g(24～28g)，未成年组(26.4±0.2)g(25～27g)，两组小鼠体重比较无差异(P＞0.05)。

1.2 小鼠颗粒细胞收集

向两组小鼠腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG)促卵泡发育与排卵。48h后处死小鼠，取出双侧卵巢，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次后置含有牛血清白蛋白的营养混合物F-12(DMEM/F-12)细胞培养基(赛默飞世尔中国)，去除卵巢周围覆盖的被膜及脂肪，PBS反复冲洗≥3次。在解剖镜下针头扎卵泡40～50次，释放卵泡中颗粒细胞与卵母细胞，加入0.05～0.15%透明质酸酶与0.025～0.05%胶原酶消化细胞间质，使释放出的细胞成为单个细胞。于5%CO2，37℃恒温箱中孵育15min，1000r/min离心5min。弃上清液后得到颗粒细胞，使用DMEM/F-12细胞培养液重新悬浮沉淀，5%CO2，37℃恒温箱中培养5min[6]。PBS洗涤3次后1000r/min离心5min。使用台盼蓝染液检测细胞活性，保证用于培养的细胞存活率＞90%。

1.3 颗粒细胞培养

将分离得到两组小鼠卵巢颗粒细胞分别进行细胞培养：使用DMEM/F-12细胞培养液稀释，计数细胞密度。置DMEM/F-12培养基5%CO2，37℃恒温箱中培养。观察到颗粒细胞贴培养基壁后，每组取50%细胞转入含促卵泡生成素(FSH)的培养基中继续培养12h作为FSH组，另50%细胞继续于DMEM/F-12培养基中培养12h作为非FSH组。

1.4 Tau蛋白在颗粒细胞中的表达

根据免疫组织化学技术是以带有显色剂的特异性抗体与抗原结合的原理为基础，通过在细胞中的呈色反应对相应蛋白进行定性、定量观察[7]。采用免疫组化法检测卵巢颗粒细胞中tau蛋白表达水平：①使用4%甲醛固定颗粒细胞30min，PBS冲洗10～15min；②3%H2O2浸泡15min后PBS冲洗15min；③滴加山羊血清封闭液，置37℃恒温箱30min，过滤封闭液；④滴加兔抗Tau多克隆抗体，置4℃冰箱过夜；⑤37℃恒温箱升温50min，PBS冲洗15min；⑥滴加生物素标记后的羊抗兔Ig G，置37℃恒温箱30min，PBS冲洗15min；⑦滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素液，37℃孵育30min，PBS冲洗15min。⑧滴加显色剂，显微镜下观察到切片组织各细胞呈现不同颜色后停止显色，蒸馏水洗涤；⑨依次使用不同浓度酒精脱水，70%脱水5min、80%脱水5min、90%脱 水5min、95%脱 水10min，二甲苯中浸泡20min。中性明胶封片，显微镜下观察颗粒细胞阳性数量。另普通兔血清代替兔抗tau抗体作为空白阴性对照。细胞内有染色为棕黄色或深棕色的颗粒为阳性。

1.5 tau蛋白在颗粒细胞中的定位

构建pcDNA3-tau，使用亚克隆技术将构建好的pc DNA3-tau转入新载体pm Cherry-C2，插入点选择多克隆位点。经聚合酶链式反应技术，扩增pmCherry-C2载体中插入的pcDNA3-tau段基因片段。培养后得到重组质粒pm Cherry-tau，即pm-Cherry-tau融合蛋白，然后对其转染：使用Polyfectine转染试剂(百恩维生物公司)，通过瞬时转染法将pmCherry-tau融合蛋白转染到成年组小鼠卵巢颗粒细胞样本上。培养24h后使用荧光显微镜(德国徕卡生物)观察颗粒细胞中pmCherry-tau融合蛋白及微管定位并采集图像。

1.6 统计学方法

采用SPSS23.0软件进行数据统计分析。计量资料采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化反应中总阳性细胞数

tau蛋白阳性细胞数成年组(45.0±3.7)高于未成年组(31.5±6.0)(t＝6.040，P＜0.001)，图1。

图1 免疫组化染色细胞(400×)

2.2 免疫组化反应成年组中FSH组与非FSH组阳性细胞数

成年组经FSH培养后卵巢颗粒细胞多为棕黄色，着色数较多；未FSH组阳性数(23.1±3.2)少于FSH组(32.1±2.8)(t＝6.716，P＜0.001)，图2。

图2 成年组卵巢颗粒细胞(400×)

2.3 免疫组化反应未成年组中FSH组与非FSH组阳性细胞数比较

未成年组中经FSH培养后卵巢颗粒细胞呈棕黄色或深棕色为阳性，着色数较少；非FSH组卵巢颗粒细胞阳性细胞较少，FSH组阳性细胞数(28.45±3.51)多于非FSH组(20.03±2.23)(t＝6.835，P＜0.001)，图3。

图3 未成年组卵巢颗粒细胞(400×)

2.4 成年组颗粒细胞中tau蛋白定位

小鼠颗粒细胞中微管发出绿色荧光，呈放射状分布；卵巢颗粒细胞中tau融合蛋白发出的绿色荧光聚集于细胞核周围，近核膜处最为密集，以核为中心呈放射状分布，与微管形态分布相似。见图4。

图4 卵巢颗粒细胞内定位(400×)

3 结论

卵巢颗粒细胞是卵母细胞增殖分化过程中必不可少的一类细胞，可从颗粒细胞形态变化判断卵泡发育过程[8]。会影响卵母细胞增殖分化过程，从而影响生育繁衍能力[9]。同时卵泡形成过程又与细胞骨架改变有关。细胞骨架包括微管、微丝及中间纤维[10]。细胞骨架不仅能维持细胞形态、承受外力，还能维持细胞内部各结构的有序排列[11]。此外还参与多种重要生命活动，如细胞物质运输、结合蛋白组成动力系统[12]。微管可于所有哺乳动物细胞中存在，是细胞骨架的结构主干，具有聚合、解聚的动力学特性，生理状态下细胞的结构及功能都取决于微管的稳定性[13]。

微管蛋白是构成微管的主要蛋白质，微管相关蛋白是细胞内除微管蛋白外能与微管结合的另一类蛋白，是维持微管结构及功能的必需成分[14]。微管相关蛋白可存在于多种细胞中，具有微管结合活性，通过调节特定氨基酸磷酸化及去磷酸化实现其生物学功能[15]。微管相关蛋白主要包括MAP1、MAP2、Tau、MAP4[16]。FSH可通过颗粒细胞表面受体，影响颗粒细胞内激酶信号途径，从而诱导微管相关蛋白MAP2D在卵巢颗粒细胞中表达水平增强[17]。MAP2D蛋白有促进微管形成，增强颗粒细胞稳定性作用，但主要位于树突及非神经元胶质细胞中，且在卵巢颗粒细胞内于特定时期聚集于高尔基体，并非直接作用于颗粒细胞内的微管结构，因此推测有其它微管相关蛋白直接对微管起调节作用[18]。微管相关蛋白tau主要存在于中枢及外周神经系统，可结合多种细胞分子，在微管等细胞骨架的形成中发挥重要作用[19]。具有促进微管蛋白形成微管、参与信息转导、维持细胞形态、参与细胞增殖分裂等作用[20]。并且tau蛋白上具有多个磷酸化位点，可增强其对微管结构的生物学作用，从而间接影响卵母细胞增殖分化过程[21]。

本研究发现，经免疫组化染色后成年组小鼠卵巢颗粒细胞阳性数明显更多，表明微管相关蛋白tau表达水平高。其原因可能是由于成年小鼠经性成熟后卵母细胞数量较多，卵巢颗粒细胞增多，则微管相关蛋白tau处于高表达状态。加FSH培养后的小鼠卵巢颗粒细胞阳性数量更高，表明FSH具有促进卵巢颗粒细胞中微管相关蛋白tau的表达作用。分析其原因，可能是因FSH具有促进卵泡发育、调节颗粒细胞骨架排序作用，在卵巢颗粒细胞中可与微管蛋白起协同作用，共同维持颗粒细胞稳定及功能。本研究标记后的tau融合蛋白在颗粒细胞中主要定位于细胞核，以此为中心呈放射状排列，且与微管在颗粒细胞内分布形态吻合。表明通过观察tau蛋白定位可反映微管在卵巢颗粒细胞中定位情况。

综上所述，微管相关蛋白tau在成年小鼠卵巢颗粒细胞中高表达，且主要聚集于细胞核，与微管分布形态相似。即微管相关蛋白tau在卵巢颗粒细胞中表达后能同时反映微管在颗粒细胞中形态变化，从而影响卵母细胞生长发育。本研究充分了解卵巢颗粒细胞中微管相关蛋白tau的表达及细胞内定位，为后续探究tau蛋白磷酸化及功能提供数据与理论支持。