何佳珂，陈志青，万蓉，饶美英，熊爱珍，洪葵

(南昌大学第二附属医院1.心内科；2.药学部；3.分子医学重点实验室；4.输血科，南昌 330006)

新型口服抗凝药利伐沙班是第一个口服直接Xa因子抑制剂，可抑制凝血酶生成[1]。用于预防髋关节和膝关节置换术后患者深静脉血栓(deep vein thrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism，PE)的形成[2-4]。也可用于预防非瓣膜性心房颤动(房颤)患者脑卒中和非中枢神经系统性栓塞，降低冠状动脉综合征复发的风险等[5-6]。一般说来，利伐沙班安全有效，但是临床常用指标如凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶原时间(activated partial prothrombin time，APTT)、国际标准化比值(international normalized ratio，INR)等不能反映利伐沙班的抗凝作用[7]，指南不建议服用利伐沙班患者进行上述检测[5]。考虑利伐沙班的血浆浓度同其抑制Xa因子活性的程度密切相关[5，7]，对利伐沙班进行血药浓度监测，尤其是针对高龄、肝肾功能不全的患者进行常规监测，将有助于评价利伐沙班的抗凝效果，促进临床安全有效用药。串联质谱法具有分析性能强、分析速度快以及灵敏度高等优点[8-14]，笔者在本实验建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)定量分析方法，测定人血浆利伐沙班浓度，以期为临床药物相互作用评价和个体化用药实践提供方法学参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 API4000+型三重四极杆质谱仪，配备电喷雾离子源(Electron Spray Ionization，ESI)及Analyst 2.0.7数据处理系统(美国Applied Biosystems公司) ；Nexera X2 UHPLC LC-30AD 液相泵(日本岛津公司)；SIL-30AC自动进样器(日本岛津公司)；CTO-30A柱温箱(日本岛津公司)；BS124S电子天平(赛多利斯Sartorious公司，感量：0.1 mg)。

1.2试药 利伐沙班标准品(Toronto Research Chemicals公司，批号：14-XJZ-49-1，含量：99.54%，规格：10 mg)；d4-利伐沙班标准品(Toronto Research Chemicals公司，批号：9-JHY-173-5，含量：98%，同位素含量：96.9%，规格：1 mg)；甲醇、乙腈为质谱纯(美国Thermo Scientific公司)；醋酸铵、甲酸为色谱纯(美国Thermo Scientific公司)。超纯水(18.2 MΩ)由Millipore 纯水装置制得。空白人血浆来自我院输血科。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm，柱号：25002-102130)；柱温：40 ℃；流动相：A相为水(含5 mmol·L-1醋酸铵和0.1%甲酸)，B相为乙腈；梯度洗脱：0～0.4 min，B10%；>0.4～0.8 min，B 10%→80%；>0.8～2 min，B80%；>2～2.1 min，B 80%→10%；>2.1～3 min，B10%；流速：0.4 mL·min-1；进样量：5 μL。

2.2质谱条件 采用ESI -正离子电离-多反应离子监测(multi-reaction monitoring，MRM)的扫描检测，利伐沙班与d4-利伐沙班的检测离子分别为m/z436.1→m/z145.1和m/z440.2→m/z145.0。离子源电压5500 V；温度450 ℃；碰撞气体(CAD)62.055 kPa；气帘气(CUR)172.375 kPa；源内气体1(GS1，N2)448.175 kPa，气体2 (GS2，N2)379.225 kPa；去簇电压分别为95 V(利伐沙班)和120 V(d4-利伐沙班)；碰撞能量分别为40 V(利伐沙班)和43 V(d4-利伐沙班)；扫描时间100 ms。

2.3标准溶液的配制 精密称取利伐沙班和d4-利伐沙班，乙腈为溶剂，配制利伐沙班和d4-利伐沙班浓度分别为1和1.07 mg·mL-1储备液，梯度稀释，配制利伐沙班标准溶液浓度分别为10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000 ng·mL-1工作液；d4-利伐沙班(内标)工作液浓度为2668 ng·mL-1。

2.4样品的处理与测定 取人血浆样品100 μL至1.5 mL离心管，加入内标d4-利伐沙班(266.8 ng·mL-1)10 μL，混匀后加入乙腈300 μL，涡旋振荡5 min，4 ℃16 000×g离心15 min，取上清液5 μL进样，测定血浆中利伐沙班的浓度。

2.5方法学验证

2.5.1专属性考察 按“2.4”项下操作，在本实验条件下，利伐沙班和内标d4-利伐沙班的保留时间约为1.81 min。通过对来自6个不同个体的空白血浆测定，表明血浆中内源性杂质不干扰样品测定，空白血浆、空白血浆添加利伐沙班和d4-利伐沙班标准品色谱质谱图见图1。

2.5.2标准曲线的绘制 制备利伐沙班血浆浓度分别为1，2，5，10，20，50，100，200，500 ng·mL-1的血浆样品。按“2.4”项操作，以样品和内标峰面积比(As/Ais)为纵坐标，浓度(C，ng·mL-1) 为横坐标，以1/C2为权重系数进行回归，得血浆中利伐沙班标准曲线，结果利伐沙班在1～500 ng·mL-1范围内线性关系良好。回归方程为：Y=0.014 8X+0.009 93，R2=0.9964，其中Y为样品和内标峰面积比(As/Ais)，X为利伐沙班浓度。

2.5.3定量下限 制备利伐沙班浓度为1 ng·mL-1的血浆样品(n=5)，按“2.4”项操作，将满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20时药物浓度作为本测定方法的定量下限，经测定本方法的利伐沙班的定量下限为1 ng·mL-1。

2.5.4精密度与准确度 制备利伐沙班浓度分别为2，50，400 ng·mL-1的血浆样品。按“2.4”项操作，测定日内变异和日间(连续考察3 d)变异。并将测定结果代入血浆标准曲线算出测定浓度，测定浓度与加入浓度相比，计算血浆利伐沙班准确度。结果显示，日内和日间精密度和准确度均<8%，符合生物样品分析要求，见表1。

图1A.空白血浆；B.空白血浆加利伐沙班(1ng·mL-1)和d4-利伐沙班(tR内标=1.81min；tR利伐沙班=1.81min)的超高效液相色谱-质谱图

A.blank plasma; B.blank plasma spiked with rivaroxaban at 1 ng·mL-1and d4- rivaroxaban

Fig.1UPLC-MS/MSchromatogramsofrivaroxabanandrivaroxabaninhumanplasmaatd4

2.5.5绝对回收率 制备利伐沙班浓度分别为2，50，400 ng·mL-1的血浆样品。按“2.4”项操作，测定结果的峰面积与相同浓度标准品溶液直接进样的峰面积相比，算得血浆中利伐沙班绝对回收率。结果表明，各浓度绝对回收率为90.09%～95.23%(表2)。

2.5.6基质效应 用空白血浆的乙腈提取液制备利伐沙班浓度分别为2，50，400 ng·mL-1样本，按“2.4”项操作，以水溶液制备相同3种浓度样本得到相应溶液的峰面积。上述样品每个浓度各配制6份测定，以乙腈提取液配制低、中、高浓度样品中利伐沙班和内标的峰面积与水溶液平均峰面积比值，评价血浆基质对测定的影响。结果显示3种浓度血浆样品利伐沙班的基质效应在93.50%～100.09%，内标d4-利伐沙班基质效应为104.66%，本试验条件下不存在明显基质效应，见表2。

表1血浆中利伐沙班定量下限、精密度和准确度测定结果

Tab.1Lowerlimitofquantitation,precisionandaccuracyofrivaroxabaninplasmasamples

%

*1代表定量下限

*1represents lower limit of quantification

表2血浆中测定利伐沙班的绝对回收率和基质效应测定结果

Tab.2Absoluterecoveryandmatrixeffectonquantificationofrivaroxabaninplasmasamples

%，n=6

2.5.7样品稳定性考察 制备利伐沙班血浆浓度分别为2，50，400 ng·mL-1血浆样品。分别进行室温稳定性试验(20 ℃放置4 h)、处理后稳定性试验(4 ℃放置24 h)、冷冻稳定性试验(-80 ℃冷冻放置50 d)和冻融稳定性试验(反复冻融处理3次)，然后按“2.4”项操作，将测定结果的峰面积比代入血浆标准曲线计算实测值，评估样品的室温、处理后、冷冻放置和反复冻融稳定性。结果表明实测值与加入量基本一致，说明利伐沙班在各条件下放置稳定(表3)。

3 讨论

笔者在本实验中建立了简便的蛋白沉淀法联合UPLC-MS/MS测定人血浆利伐沙班浓度，以期转化应用于临床实践。本方法定量下限为1 ng·mL-1，灵敏度更高[8-12]，适合对人血浆中痕量利伐沙班进行定量检测。血浆样品处理过程采用乙腈沉淀血浆蛋白，提取回收率90.09%～95.23%，方法稳定性好，与固相萃取相比[13-14]，操作简便、快速，成本低，大大降低了样品处理过程中污染的可能性，适用于大量生物样本的快速处理，可确保临床测定的准确性。

表3血浆利伐沙班样品稳定性实验结果

Tab.3Stabilityresultsofrivaroxabaninplasmasamples

%，n=5

同时，为更好适应临床样品分析需求，提高化合物响应，在液相色谱条件优化过程中采用梯度洗脱方式，并发现流动相水相加入5 mmol·L-1醋酸铵和0.1%甲酸后，利伐沙班色谱峰尖锐、对称。本方法分析时间仅为3 min，显著短于文献报道的HPLC-MS/MS方法[8，10-12，14]，可为临床大样本和复杂基质组分的分析节约时间。利伐沙班和内标d4-利伐沙班具有较好的色谱行为，保留时间1.81 min，血浆中基质对测定无干扰，方法选择性好。