张建芳，李世勇，韩嫱，罗爱林，任杰

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，武汉 430030；2.济南市中心医院麻醉科，济南 250000)

老年(≥60岁)患者接受全身麻醉手术后，约41.4%可发生术后认知功能障碍(postoperation cognitive dysfunction，POCD)，严重影响了患者的生活质量并增加了社会医疗保健负担，目前临床尚无有效的防治方法[1]。虽然POCD的发病机制尚不清楚，但多项研究显示，全身麻醉药是引起POCD的主要原因之一[2]。临床相关浓度异氟烷可致实验动物脑内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)过度表达，进而导致神经元损伤，最终引起认知功能障碍[3-4]。脂氧素A4 (lipoxin A4，LXA4)是一类重要的内源性促炎症消退脂类递质，被称为炎症反应的“刹车信号”[5-6]。研究表明，LXA4可通过血脑屏障，抑制脑缺血及其他神经退行性疾病中的神经炎症反应，从而减轻神经细胞损伤，发挥神经保护作用[7]。但LXA4能否减轻异氟烷诱发的老年大鼠海马神经炎症及认知功能损伤尚不清楚。笔者在本研究观察LXA4预处理对异氟烷所致老年大鼠海马炎症反应和认知功能障碍的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠，18～20个月龄，体质量350～400 g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2004-0007，实验动物合格证号：NO.4200400243。饲养于温度(22±1)℃、相对湿度(60±5)%、明暗各12 h交替(7：00—19：00)通风干燥环境，提供充足的标准化饮食。

1.2药品与试剂 LXA4 购自美国Sigma公司(批号：437720)，异氟烷购自美国Baxter公司(批号：N008B008)，核因子κB抑制因子α(nuclear factor of kappa alpha，IκBα)购自美国Sigma公司(批号：BAY 11-7082)，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )试剂盒购自美国BioSource公司(IL-6批号：145466017，IL-1β批号：145530029，TNF-α批号：145356008)。

1.3仪器与设备 Biomedical全自动血气分析仪(美国NOVA公司，型号：PHOX PLUS)，Ethovision动物运动轨迹记录系统(荷兰Noldus公司，型号：ETHOVISION PRO)。

1.4实验分组与给药方法 采用随机数字表法，将SD大鼠随机分为4组(n=30)：对照组(C组)、异氟烷组(I组)、LXA4+异氟烷组(L+I组)和LXA4组(L组)。异氟烷麻醉开始前，L组和L+I组脑室注射0.3 nmol·L-1LXA4 5 μL(溶于0.9%氯化钠溶液)[7]。C组和I组给予等量0.9%氯化钠溶液。将大鼠放入麻醉箱中，麻醉箱放入25 ℃恒温箱内与麻醉机相连，以30%O2-70%N2混合气体作为载体气体，通气流量2 L·min-1。C组和L组大鼠给予30%O2-70%N2混合气体6 h，I组和L+I组大鼠给予1.4%异氟烷6 h。麻醉完成后关闭异氟烷挥发罐，继续保持通气。

1.5动脉血气分析 麻醉结束后，用32号针头立即取左心室血液200 μL，采用Biomedical全自动血气分析仪进行动脉血气分析，测定血气指标和血糖水平。

1.6炎症因子检测 麻醉结束后，每组每个时间点(麻醉后0，3，6，12和24 h)取大鼠5只，按照ELISA 试剂盒说明书检测海马TNF-α、IL-1β 和IL-6表达。

1.7Western blotting检测海马组织蛋白 冰上分离大鼠海马组织后裂解，提取总蛋白。Western blotting法检测海马组织相应蛋白水平。Image Lab 3.0版软件进行灰度分析。以目的蛋白与β-actin灰度值的比值反映其表达水平。

1.8认知功能测定 待其余大鼠完全清醒后送回笼中，麻醉结束后第2周参照文献[8]进行Morris水迷宫实验。Ethovision动物运动轨迹记录系统自动记录大鼠游泳轨迹。以大鼠入水至爬上平台的时间为逃避潜伏期，取每天测试平均值。将60 s内找不到平台的大鼠放于平台上15 s，逃避潜伏期记为60 s，连续训练4 d，记录逃避潜伏期。于第5天将平台撤去。从同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录120 s内大鼠在4个象限的游泳时间百分比及穿过原平台所在位置的次数。

2 结果

2.1异氟烷麻醉对大鼠循环和呼吸功能的影响 见表1。4组大鼠血液pH值、二氧化碳分压(PaCO2)、氧分压(PaO2)、血糖及氧饱和度(SaO2)比较，均差异无统计学意义。提示异氟烷麻醉对大鼠循环和呼吸功能无影响。

2.2LXA4预处理改善异氟烷麻醉后认知功能 训练的第3天和第4天，与I组比较，L+I组大鼠定位平台时间更短，在目标象限时间百分比更大(P<0.05)。L组与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3LXA4对异氟烷诱导的海马内炎症因子水平上调及IκBα表达水平下调的影响 与C组比较，I组麻醉后0，3，6 h海马内IL-1β和 IL-6表达明显上调(P<0.05)，麻醉12 h后达基线水平；麻醉后0，3，6，12 h海马内TNF-α表达明显上调(P<0.05)，麻醉24 h后达基线水平；麻醉后0，3，6 h海马内IκBα表达下调(P<0.05)，12 h后恢复正常；与I组比较，L+I组麻醉后0，3，6 h海马内TNF-α、IL-1β和 IL-6表达下调，IκBα表达上调(P<0.05)；各时间点L组和L+I组海马内TNF-α、IL-1β、IL-6 及IκBα表达差异无统计学意义(图2)。

表14组大鼠动脉血气指标和血糖水平比较

Tab.1Comparisonofarterialbloodgasindexandbloodglucoselevelsamongfourgroupsofrats

组别pH值PaCO2PaO2kPaC组7.31±0.054.80±0.5913.97±1.73I组7.33±0.044.83±0.3314.23±1.46L+I组7.32±0.065.16±0.4913.83±1.20L组7.31±0.045.28±0.3114.36±1.60组别血糖/(mmol·L-1)SaO2/%C组4.42±0.3398.87±0.95I组4.58±0.4697.25±0.76L+I组4.25±0.6696.78±0.89L组4.44±0.6199.24±0.73

2.4异氟烷和 LXA4对海马内IκBα表达水平的影响 麻醉后2周，与C组比较，I组IκBα表达差异无统计学意义(P>0.05)。与I组比较，I+L组IκBα表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。提示异氟烷和 LXA4对海马内IκBα表达水平的影响持续时间不长。

3 讨论

异氟烷是临床常用吸入麻醉药，研究证实，1.4%异氟烷处理小鼠2，6，24 h后，海马内TNF-α、IL-1和IL-6表达增高，诱导神经炎症发生和发展，损伤学习和记忆功能[3，9]。1.4%异氟烷与临床麻醉所用的浓度接近，笔者在本研究选择1.4%异氟烷麻醉6 h建立异氟烷诱发老年大鼠认知功能障碍模型。异氟烷处理过程中，各组动脉血气和血糖指标差异无统计学意义，表明异氟烷未对循环系统和呼吸系统产生明显抑制。

研究表明，在神经退行性疾病中，TNF-α和 IL-1β参与了海马内神经炎症反应，而阻止TNF-α和 IL-1β释放可以改善认知功能[10]。笔者在本研究发现，与C组比较，I组麻醉后0，3，6 h TNF-α、IL-1β和 IL-6表达明显上调；麻醉后0，3，6 hIκBα表达下调，第3～4天逃避潜伏期延长，探索时间缩短。提示1.4%异氟烷可诱导海马内TNF-α、IL-1β和IL-6释放，可能参与诱导神经炎症的发生和发展，从而导致老年大鼠发生认知功能障碍。

与C组比较，*1P<0.05；与I组比较，*2P<0.05

Compared with group C,*1P<0.05; Compared with group I,*2P<0.05

LXA4是花生四烯酸的代谢产物，在炎症等病理过程中具有抗炎和促炎症消退作用[11]。在诸多神经系统疾病中，LXA4可以通过抑制胶质细胞激活、降低炎症因子(TNF-α、IL-1β)活性等发挥神经保护作用[12]。研究发现，与I组比较，L+I组在麻醉结束后0，3，6 h TNF-α、IL-1β和 IL-6表达下调，IκBα表达上调，LXA4预处理可抑制异氟烷诱导的炎症因子的增加；L组和L+I组各时间点TNF-α、IL-1β及IL-6表达差异无统计学意义；麻醉结束后24 h，各组TNF-α、IL-1β及IL-6差异无统计学意义。与I组比较，L+I组第3～4天逃避潜伏期缩短，探索时间延长，提示LXA4预处理可减轻异氟烷诱发的神经炎症反应，改善异氟烷麻醉诱发的老龄大鼠认知功能障碍。

LXA4能抑制炎性刺激引起的多种细胞因子、趋化因子、黏附分子表达，其机制与抑制NF-κB活性相关[11]，而IκBα降解是NF-κB释放的中心环节[13]。LXA4抑制TNF-α、IL-1β和 IL-6增加，其机制可能是抑制IκBα蛋白降解，通过衰减IκBα降解抑制NF-κB转录活性，从而抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和 IL-6等的释放，减轻神经炎症反应，改善认知功能。笔者在本研究中发现，与C 组比较，I组麻醉后0，3，6 h IκBα表达下调，12 h后恢复正常；与I组比较，L+I组IκBα表达上调；L组和L+I组各时间点IκBα表达差异无统计学意义。

A-C.大鼠海马TNF-α、IL-1β和 IL-6表达情况；D.大鼠脑内IκBα表达情况；与C组比较，*1P<0.05；与I组比较，*2P<0.05

A-C.expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 in hippocampus of rats; D.IκBα expression in hippocampus of rats；Compared with group C,*1P<0.05; Compared with group I,*2P<0.05

图3水迷宫实验后2周4组大鼠海马内IκBα表达情况

Fig.3IκBαexpressioninthehippocampusoffourgroupsofratsafterwatermazetest

综上所述，LXA4预处理可减轻1.4%异氟烷致老年大鼠认知功能障碍，其机制可能与LXA4降低老年大鼠海马中促炎细胞因子有关。