孔岚，白玉，韩圣娜

(1.郑州大学附属肿瘤医院麻醉科，郑州 450008；2.郑州大学基础医学院药理学教研室，郑州 450002)

肺缺血-再灌注损伤是造成急性肺损伤的常见原因，多见于失血性休克、肺移植、体外循环手术、心脏骤停复苏等。研究表明，肺组织氧化应激反应和细胞凋亡与肺缺血-再灌注损伤的发生发展密切相关[1]，右美托咪定是高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，有研究显示该药可减轻大鼠肺缺血-再灌注损伤[2-3]，但机制尚不明确。笔者在本实验研究右美托咪定预处理对大鼠肺缺血-再灌注损伤的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级SD大鼠，2个月龄，雄性，体质量240～300 g，由郑州大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(豫) 2017- 0009，实验动物合格证号： HG0016。 饲养环境：屏障环境，相对湿度 40%～70%，温度20～26 ℃，人工光照，昼夜明暗交替，空气洁净度10 000级，落下细菌数≤每皿3个，噪声≤60 db，自由摄食、饮水，建模前12 h禁食，本研究已获得郑州大学附属肿瘤医院动物伦理委员会批准同意。

1.2药品与试剂 右美托咪定(江苏恩华药业股份有限公司，批号：20170702，规格：1 mL：100 μg)；丙二醛(MDA)试剂盒(批号：1508)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：1672)均购自南京建成科技有限公司；肝素钠(南京新百药业有限公司，批号：H32035851，规格：2 mL：12500 U)，B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2 associated X protein，bax)、 B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，bcl-2)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(中国碧云天生物技术研究所，批号分别为C1256，C1305，C1375，C1298)，二抗工作液(中国碧云天生物技术研究所，批号：SC6753，SC7876，SC8562，SC5219)。

1.3仪器与设备 HX-100E小动物呼吸机(中国成都泰盟科技有限公司)，电泳仪(美国Bio-rad公司)。

1.4动物分组与模型的制备 采用随机数字表法将大鼠分为3组(n=16)，假手术组(S组)只开左胸不夹闭肺门；缺血-再灌注(IR)组夹闭左肺门使左肺缺血45 min，再恢复灌注2 h；右美托咪定预处理+缺血-再灌注组(D组)夹闭左肺门前20 min经股静脉注射右美托咪定20 μg·kg-1。 参照改良的EPPINGER法[4]建立肺缺血-再灌注模型，大鼠经腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，置于有保温设备的实验台上仰卧位固定，气管切开后插管，接小动物呼吸机，机械通气，潮气量双侧肺通气15～20 mL·kg-1，单侧肺通气8～10 mL·kg-1，通气频率60次·min-1，吸气与呼气比为1：2。维持呼气末二氧化碳分压(end tidal carbon dioxide tension，PETCO2)4.66～5.98 kPa，股静脉置入24 G静脉留置针，便于给药和输液。修剪左胸部皮毛，涂抹脱毛剂去毛，75%乙醇、碘酊消毒左胸部皮肤，逐步分离肌肉、筋膜，切断肋骨后打开胸腔，暴露左肺，无损伤钳游离左肺门，静脉注入肝素钠50 U，10 min后用无创血管夹夹闭左肺门45 min，可见左肺颜色从红色变为暗红色，说明缺血成功，45 min后松开血管夹恢复血供，左肺由暗紫色转为红色，表明再灌注成功。再灌注2 h后处死大鼠，留取左肺组织。制备模型过程中使用BWZ-50C6微量泵(浙江史密斯医学仪器有限公司)静脉泵注乳酸钠林格液6 mL·kg-1·h-1。

1.5测定大鼠肺组织湿/干重比(Wet/Dry，W/D)以及总肺含水量(total lung water，TLW) 处死大鼠，取左肺组织，用0.9%氯化钠溶液充分漂洗，多余水分用滤纸吸干，称重量即为湿重(W)；80 ℃恒温箱中烘干48 h，称干重(D)，计算肺W/D。TLW=(W-D)/D。另取部分左肺组织置于甲醛溶液，石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察、比较各组肺组织病理学特征。

1.6肺组织MDA含量和SOD活性测定 取部分左肺组织，制备10%组织匀浆，低温离心后取上层悬液，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。

1.7Western blotting测定bax、caspase-3、bcl-2蛋白表达 取部分肺组织，研磨为组织匀浆，高速低温离心，取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，37 ℃反应后分别加入bax、caspase-3、bcl-2一抗和GAPDH一抗4 ℃下过夜，加入二抗室温下反应1.5 h。化学发光、显影、定影。Quantity One图像分析软件进行半定量分析。

2 结果

2.1肺组织W/D与TLW 与S组比较，其他两组W/D升高，差异有统计学意义 (F=98.152，94.131，P<0.01)，TLW均升高，差异有统计学意义(F=96.172，92.386，P<0.01)；与IR组比较，D组W/D、TLW明显降低，差异有统计学意义(F=105.163，101.231，P<0.01)。见表1。

2.2肺组织结构 S组大鼠肺组织结构未见明显损伤性改变，肺泡及肺泡壁结构完整，肺间质无水肿，无中性粒细胞浸润；IR组肺泡结构破坏严重，肺泡内及肺泡壁充血实变，肺间隔增厚，肺泡腔和间质严重水肿，并可见大量红细胞漏出，中性粒细胞明显浸润。D组肺组织损伤程度明显减轻，肺泡及肺间质仅少量中性粒细胞浸润。

表13组肺组织W/D与TLW测定结果

组别大鼠数W/DTLWS组164.31±0.283.29±0.26IR组165.99 ±0.41*14.71±0.39*1D组165.30±0.12*1*24.23±0.21*1*2

与S组比较，*1P<0.01；与IR组比较，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

2.3肺组织MDA含量及SOD活性比较 与S组比较，其他两组肺组织MDA含量升高，差异有统计学意义(F=91.769，95.832，P<0.01)；SOD活性降低，差异有统计学意义(F=104.335，97.356，P<0.01)；与IR组比较，D组肺组织MDA含量降低(F=95.534，P<0.01)，SOD活性升高，差异有统计学意义(F=96.769，P<0.01)，见表2。

表23组大鼠肺组织MDA含量与SOD活性测定结果

组别大鼠数MDA/(nmol·mg-1)SOD/(U·mg-1)S组160.372±0.019 112±5 IR组160.671±0.036*1 61±6*1D组160.536±0.059*1*2 75±8*1*2

与S组比较，*1P<0.01；与IR组比较，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

2.4肺组织bax、caspase-3、bcl-2蛋白表达比较 与S组比较，其他两组肺组织bax蛋白表达升高，差异有统计学意义(F=102.535，99.765，P<0.01)，caspase-3蛋白表达升高(F=103.325，95.126，P<0.01)，bcl-2蛋白表达降低(F=98.635，95.396，P<0.01)，差异有统计学意义；与IR组比较，D组肺组织bax、caspase-3蛋白表达降低(F=97.215，94.156，P<0.01)，bcl-2蛋白表达升高(F=106.235，P<0.01)，差异有统计学意义，见表3。

3 讨论

肺缺血-再灌注损伤是临床常见问题，也是急性肺损伤的主要原因之一。预防和减轻肺缺血-再灌注损伤一直是临床研究热点。右美托咪定是一种高选择性α2-肾上腺素受体激动药，目前已发现其对缺血-再灌注所引起的脏器损伤具有良好的保护作用，机制与抗氧化应激、抑制炎症细胞因子释放以及抗细胞凋亡等有关[5-6]。目前临床围术期右美托咪定多预先给药，因此本研究亦采用右美托咪定预处理方式，以更接近临床实践。笔者根据相关报道选取右美托咪定浓度[7]，即于缺血前20 min给予右美托咪定20 μg·kg-1。笔者在本研究采用改良EPPINGER[4]法建立大鼠肺缺血-再灌注模型，结果显示，IR组肺组织W/D、TLW均升高，肺组织形态、结构均发生明显损伤性改变，提示大鼠肺缺血-再灌注损伤模型制备成功。D组肺组织病理损伤明显轻于IR组，提示右美托咪定能减轻肺组织损伤。

表33组大鼠肺组织bax、caspase-3、bcl-2蛋白表达情况

组别大鼠数baxcaspase-3bcl-2S组1698.76±12.3799.98±13.1699.85±11.02IR组16234.12±26.35*1197.75±21.08*138.67±5.18*1D组16172.23±16.87*1*2143.79±14.25*1*268.91±7.76*1*2

与S组比较，*1P<0.01；与IR组比较，*2P<0.01

Compared with S group，*1P<0.01；Compared with IR group，*2P<0.01

组织器官发生缺血-再灌注时，体内氧自由基生成增多，膜磷脂中多不饱和脂肪酸与氧自由基发生脂质过氧化反应，产生大量有毒脂质过氧化产物，造成并加重组织损伤[8-11]。SOD是体内最主要的抗氧化酶和自由基清除剂，可以将脂质过氧化产物(如MDA等)歧化为过氧化氢和水，清除氧自由基并终止自由基病理性连锁反应，保护细胞免受损伤，其活性高低可反映机体清除氧自由基的能力[12]。MDA含量可直接反映机体脂质过氧化反应的程度，间接反映细胞损伤的程度[13]。本研究中，与S组比较，IR组肺组织MDA含量明显升高，SOD活性明显降低，说明大鼠肺缺血-再灌注损伤过程有氧化应激反应参与；D组肺组织MDA含量明显较IR组降低，SOD活性明显较IR组升高，提示右美托咪定可能通过抑制氧化应激反应减轻大鼠肺缺血-再灌注损伤。

研究表明，在IR损伤中，细胞凋亡是再灌注后炎性反应和组织损伤的重要因素[14]。因此细胞凋亡在肺缺血-再灌注损伤中具有重要作用[15]。bcl-2和bax对调节细胞凋亡非常重要，bcl-2使细胞色素C释放减少，具有抑制细胞凋亡作用，bcl-2介导的抑制凋亡作用能被bax所拮抗，两者处于平衡状态。缺血-再灌注会影响细胞中这种平衡，导致细胞色素C大量释放进入胞质，引起细胞caspase凋亡途径被激活，发生细胞凋亡、组织功能损伤[16]。本研究中，与S组比较，IR组大鼠肺组织bax、caspase-3表达量升高明显，bcl-2表达降低明显，提示缺血-再灌注可造成肺组织细胞过度凋亡。D组大鼠肺组织bax、caspase-3表达量明显较IR组低，bcl-2表达量明显较IR组高。提示右美托咪定可以抑制细胞凋亡。

总之，右美托咪定可以通过抑制氧化应激反应及细胞凋亡来减轻大鼠肺缺血-再灌注损伤。