成志勇，张丽军，付建珠，刘 芳，颜晓燕，孙立娜，孙雪珊，王素云

（1.保定市第一医院血液内科，河北保定071000；2.承德医学院研究生院，河北承德067000；3.保定市儿童医院病理科，河北保定071000；4.河北省人民医院血液内科，河北石家庄050000）

程序性死亡受体-1（programmed death-1，PD-1）主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞表面，与细胞凋亡密切相关［1］。程序性死亡配体-1（programmed death-ligand 1，PD-L1）是PD-1的配体，主要表达于抗原递呈细胞（APC）及肿瘤细胞［2］。免疫应答过程中，肿瘤细胞及APC将肿瘤抗原递呈至T细胞后，可刺激其淋巴细胞表达PD-1，募集细胞内SHP-2磷酸酶，通过阻断抗凋亡因子Bcl-xL的表达，抑制T、B细胞增殖，传递免疫抑制信号，形成免疫抑制的微环境［3］。同时肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平也在PD-1与促炎症因子的诱导下上调，增强肿瘤细胞抗杀伤的能力，起到免疫负调控作用［4］。在肿瘤患者的T淋巴细胞中，调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）所占比例明显升高，并抑制具有抗肿瘤活性效应的T淋巴细胞［5］。PD-1/PD-L1信号通路在Treg细胞的生成过程中起诱导促进作用［6］。研究表明，在多种恶性肿瘤中过度表达PD-L1和或PD-1，导致Treg活性增强，并与不良预后相关［3-4］。在不同类型白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等恶性血液病患者中亦存在PD-1及PD-L1表达［7-8］，PD-1抑制剂nivolumab在经典型霍奇金淋巴瘤的治疗上已经取得成功［2，7］。在髓系恶性肿瘤中，抗PD-1单克隆抗体协同去甲基化药物用于治疗急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征［9］，具有良好疗效，而在骨髓增殖性肿瘤中目前尚未有相关报道。骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病。在大部分真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）及半数原发性血小板增多症（essential thrombocythema，ET）、原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）患者存在 JAK2 V617F突变。该突变导致酪氨酸激酶过度活化并持续激活JAK/STAT信号通路［10］。本研究探讨了PD-1/PD-L1及CD4+/CD8+比值、Treg在JAK2 V617F突变阳性MPN患者骨髓中的表达及其相互关系，为MPN靶向治疗及评价疗效提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2016年1月至2018年3月于保定市第一医院、河北省人民医院收治的45例JAK2 V617F突变阳性的MPN患者，其中男22例，女23例，年龄30～82岁，中位年龄55岁。其中ET 17例（男7例，女10例）、PV 13例（男7例，女6例）、PMF 15例（男8例，女7例）；包括初治组30例（男14例，女16例）、治疗组15例（男8例，女7例）。对照组（健康志愿者）15例（男8例，女7例，中位年龄55岁）。其诊断均符合2016 WHO血液病诊断标准。所有患者均知情同意，研究方案均通过保定市第一医院伦理委员会批准（批准文号2012 0701）。

治疗组所用治疗方案：应用干扰素-α2b（Interferon-α2b，IFN-α2b）皮下或肌肉注射，300 U/次，3～7次/周，至少应用6个月以上，必要时应用羟基脲调整白细胞、血红蛋白及血小板数量。

1.2 主要试剂

p-JAK2、PD-1、PD-L1 抗 体 购 自 美 国Proteintech生物技术有限公司；FITC标记的CD3、CD4、CD8单抗，PE标记的CD25单抗及APC标记的Foxp3单抗购自美国BD公司。血液基因组DNA提取试剂盒购自北京博迈德生化科技有限公司；引物序列根据NCBI公布的相应基因序列设计并由北京赛百盛公司合成；TaqMan购自ABI公司。

1.3 实时荧光定量PCR

①采集新鲜骨髓液4 mL，肝素抗凝。②DNA提取试剂盒提取基因组DNA。③实时荧光定量PCR反应：反应体系共25 μL。反应条件为50℃2 min，95℃10 min一个循环，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，同时设标准品和空白对照。PCR反应前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处作为阈值，各荧光信号到达所设定的阈值的循环数即为Ct值。根据标准品计算JAK2和JAK2 V617F的绝对拷贝数量。计算JAK2 V617F/JAK2比值。PCR引物序列及探针如下：JAK2 上游引物：5′-CAG CAA GTA TGA TGA GCA AGC TTT-3′，下游引物：5′-TGA ACC AGA ATA TTC TCG TCT CCA C-3′，MGB-Probe 5′-FAM-TCA CAA GCA TTT GGT TTT-MGB-3′，JAK2 V617F 下游引物：5′-CCA GAA TAT TCT CGT CTC CAC TGA A-3′。

1.4 免疫组织化学染色

组织蜡块4 μm切片，45℃烤片3 h，脱蜡，蒸馏水冲洗2遍，抗原修复后加3%过氧化氢，阻断内源性过氧化氢酶的活性，PBS冲洗3次，加入一抗（p-JAK2、VEGF、CD105，工作浓度分别为 1∶200、1∶200、1∶50、）4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加Elivision plus试剂盒中试剂A（增强剂）、试剂B（酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物），PBS冲洗后，加DAB显色，以胞膜或胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片。

免疫组化判定标准：以细胞胞浆内出现棕色染色颗粒为阳性。选取3个高倍镜视野区域（×400）计数阳性细胞数占全部细胞的比例。

1.5 流式细胞术淋巴细胞亚群及Treg细胞检测

外周血单个核细胞中加入荧光素标记的单克隆抗体CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3和小鼠IgG1-FITC及小鼠IgG2-PE做为对照（美国BD公司）直接标记全血细胞，溶血素溶解红细胞，PBS洗涤2次，流式细胞仪（美国BD公司）检测淋巴细胞，CellQuest软件获取分析细胞进行分析，计算CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。

1.6 统计学分析

所有数据用SPSS 19.00统计软件分析处理。免疫组化及淋巴细胞亚群数据各组之间比较，其中p-JAK2、CD 8%方差齐，故差异选用方差分析，各组间两两比较选用q检验；其余各检测指标经检验方差不齐，故差异选用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）。Pearson线性相关分析JAK2 V617F突变量与PD-1、PD-L1、CD4+/CD8+、Treg细胞之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JAK2 V617F突变在患者中的表达情况

所有患者在初次治疗时均经定量PCR检测为JAK2 V617F突变阳性，患者突变量在30%～96%之间。其中初治组30例，突变量（52±18）%，干扰素治疗组15例，突变量（39±17）%，前者明显高于后者，P＜0.05。对照组均未检测到JAK2 V617F突变。

2.2 免疫组织化学染色检测p-JAK2、PD-1/PDL1在MPN患者中的表达水平

p-JAK2、PD-1、PD-L1蛋白均表达于细胞膜及细胞质，三者骨髓细胞中阳性率在初治组（分别为80±23、50±24、55±21）中表达最高，其次为治疗组（分别为58±18、26±16、31±16），对照组（分别为41±13、6±3、5±4）表达最低，差异均有统计学意义（P均＜0.01；图1，表1）。

2.3 淋巴细胞亚群及Treg细胞在各组中的表达水平

初治组、治疗组和对照组淋巴细胞亚群结果显示：CD4+T细胞及CD4+/CD8+初治组低于治疗组和对照组（P均＜0.05），治疗组低于对照组（P＜0.05）。CD8+T细胞初治组高于治疗组和对照组（P均＜0.05），治疗组高于对照组（P＜0.05；表2）。初治组、治疗组和对照组Treg细胞结果显示：3组之间均有统计学差异（P＜0.05），其中初治组（14±7）%高于治疗组（7±4）%和对照组（1.78±0.96）%，治疗组高于对照组（表2）。

图1 免疫组织化学染色检测p-JAK2、PD-1、PD-L1表达水平Fig.1 Immunohistochemical staining analysis of the expression levels of p-JAK2，PD-1 and PD-L1 protein

表1 初治组、治疗组及对照组JAK2 V617F与PD-1及PD-L1表达结果Table 1 The expression levels of JAK2 V617F and PD-1，PD-L1 in newly diagnosed group，treatment group and control group （X ±S，%）

2.4 JAK2 V617F突变量与PD-1、PD-L1、CD4+/CD8+、Treg细胞相关分析

Pearson线性相关分析显示初治MPN患者的JAK2 V617F突变量与PD-1、PD-L1正相关，与CD4+/CD8+负相关（r=0.593，P＜0.01；r=0.723，P＜0.01；r=-0.771，P＜0.01），与Treg细胞比例无相关性（P＞0.05）。PD-1与PD-L1正相关（r=0.561，P＜0.01），PD-L1与CD4+/CD8+比值负相关（r=-0.585，P＜0.01），而PD-1、PD-L1与Treg细胞比例均无明显相关性（P＞0.05）。

表2 各组外周血淋巴细胞亚群及Treg细胞检测结果Table.2 Peripheral lymphocyte subsets and Treg cell test results （X ±S，%）

3 讨论

JAK2 V617F点突变为Ph染色体阴性MPN患者常见的基因突变，该突变在缺少细胞因子情况下导致JAK2磷酸化，从而诱发肿瘤［10］。本研究所选45例患者（包括初治组30例，治疗组15例）均为JAK2 V617F突变阳性。

PD-1及PD-L1可表达于多种肿瘤表面的共抑制分子，其与肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明，其在介导多种实体肿瘤细胞免疫逃逸中发挥重要作用。在多种白血病、骨髓瘤及淋巴瘤等恶性血液病中存在PD-1及PD-L1高表达［7-9］。本研究显示，在MPN患者骨髓髓系细胞中，亦存在PD-1及PD-L1高表达，同时与JAK2 V617F突变量正相关。

在人体免疫应答中，肿瘤细胞及APC将肿瘤抗原递呈至T细胞后，可刺激其淋巴细胞表面的PD-1的表达，进而抑制T、B细胞增殖，并传递免疫抑制信号，形成免疫抑制的微环境［1-3］。本研究显示，除PD-L1表达于骨髓增殖性肿瘤细胞表面外，在肿瘤细胞中同时存在PD-1高表达，同时PD-L1与PD-1两者正相关。分析原因，可能存在PD-1伴随PD-L1表达，或可能与PD-L1相互结合，亦传递抑制信号，进而抑制骨髓内淋巴细胞活化，形成免疫抑制微环境，促进MPN细胞生长。

PD-1/PD-L1通路协助肿瘤免疫逃逸的具体机制可能包括①诱导T细胞耐受；②抑制T细胞增殖及活化；③减少细胞因子的分泌；④增强Treg细胞的功能；⑤阻断抗原呈递过程［11］。研究表明在多种肿瘤患者的T淋巴细胞中，Treg细胞所占比例明显升高，且具有抗肿瘤活性效应的T淋巴细胞受其抑制［5］。此外，PD-1/PD-L1信号通路在Treg细胞的生成过程中起诱导促进作用，同时参与了Treg细胞的抑制功能［12］。JAK-STAT传导路径广泛参与CD4+T细胞的分化，有研究表明在TGF-β和IL-2作用下通过JAK-STAT调控Treg细胞分化。同时JAK-STAT信号通路活化能够上调PD-L1的表达。转录因子STAT可直接结合到PD-L1的启动子区，从而促进PD-L1的转录［5］。本研究表明，在初治MPN中存在PD-1及PD-L1高表达，同时存在CD4+/CD8+比例倒置及Treg细胞表达明显高于治疗组及对照组，PD-1及PD-L1与CD4+/CD8+比值均存在负相关，虽然未检测到JAK2 V617F及PD-1、PD-L1与Treg细胞的相关性，可能与标本量少有关。

干扰素在不同肿瘤中的其作用机制及与PD-1/PD-L1之间的相互关系尚不明确。在部分胃腺癌细胞中，干扰素γ能够诱导PD-L1表达，进而促进T细胞凋亡，而阻断PD-L1可以逆转了上述效应［13］。而在肺癌恶性胸腔积液中，高表达PD-Ll转基因细胞可显著抑制干扰素γ的分泌，并诱导CD8+T细胞凋亡［14］。在MPN患者中，应用IFN-α 2b后，约80%的患者可获得血液学反应，能够减少JAK2 V617F突变量，甚至部分患者能够达到分子生物学缓解［15］。本研究结果显示，在JAK2 V617F阳性MPN患者在应用IFN-α2b后JAK2 V617F突变量明显减少，同时PD-1/PD-L1及Treg细胞比例同样表达下调。

通过本研究，我们初步探讨了JAK2 V617F阳性MPN中PD-1/PD-L1及CD4+/CD8+比值、Treg细胞比例与JAK2 V617F突变量的相互关系，为靶向MPN提供了理论依据。