肖晓慧，李益清,黄克智，谢双锋，肖 洁，马丽萍，尹松梅，聂大年

（广东省恶性肿瘤表观遗传学和基因调控重点实验室//中山大学孙逸仙纪念医院血液内科，广东广州510120）

核输出蛋白 1（exportin-1，XPO1），又称为染色体区域稳定蛋白1（chromosome region maintenance 1，CRM1），是一种广泛存在的核输出受体蛋白，可识别超过200种蛋白，如关键肿瘤抑制蛋白和调节蛋白 p53、p73、p21、p27、IκB、Rb、BRCA1等，这些蛋白被称为XPO1的货物蛋白［1］，XPO1可以将其通过核孔从胞核转运到胞浆。XPO1的抑制剂KPT-330口服具有良好的生物利用度，我们和其他研究小组报道了KPT-330对多种血液肿瘤［2-3］和实体瘤［4-5］的作用，当前临床试验已经进入了Ⅱ/Ⅲ期［6-8］。第二代XPO1抑制剂KPT-8602在患者源性异种移植小鼠模型中有更低的中枢神经渗透浓度，不会引起厌食、恶心，显示出更强的生物耐受性和更强的效果［9］。KPT-8602对复发/难治性多发性骨髓瘤、转移性结直肠癌、转移性去势抵抗性前列腺癌和高危骨髓增生异常综合征患者的安全性、耐受性和功效研究也进入了临床试验的Ⅰ/Ⅱ期（NCT02649790）。非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是一组具有不同的组织学特点和起病部位的淋巴瘤，易发生早期远处扩散。难治或复发的NHL预后差，缺乏有效的治疗方案。一项纳入79名各型难治或复发的NHL患者的临床研究结果表明KPT-330以35 mg/m2的剂量口服是安全的，并且对难治或复发的NHL患者具有令人鼓舞和持久的抗癌活性［10］（NCT01607892）。但是 KPT-8602对NHL的研究未见报道。本研究以人组织细胞淋巴瘤细胞系U937细胞为研究对象，探讨KPT-8602对淋巴瘤细胞的作用及其可能的机制，以期对NHL的治疗提供新依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人组织细胞淋巴瘤细胞系U937购自中国科学院细胞库。细胞接种于用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，置于含体积分数5%CO2的37℃培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）提取于健康自愿献血者外周静脉血。KPT-8602粉末（美国Selleck）溶于DMSO中制成浓度为1×107nmol/L的原液，实验时用完全培养液稀释成工作液，DMSO的终体积分数浓度小于0.1%。RPMI1640培养基（美国Gibco）；胎牛血清（以色列Biological Industries）；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（美国Invitrogen）；Cell Counting Kit-8试剂盒（日本Dojindo Laboratories）；BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪）；核蛋白-胞浆蛋白提取试剂盒（美国 ThermoFisher）；ECL发光液（美国Millipore）；抗 GAPDH 抗 体（英 国 Abcam，ab181602）；抗 XPO1抗体（美国 Santa Cruz，sc-74454）；抗 Caspase-3抗 体（英 国 Abcam，ab32351）；抗 AKT抗 体（美 国 Cell Signaling Technology，#4691）；抗 p-AKT（Ser473）（美 国Affinity Biosciences，AF0016）；抗 Lamin-B1抗体（美国Immunoway，YT2522）；抗P21 cip1抗体（美国 Cell Signaling Technology，#2947）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（美国Cell Signaling Technology，#7074）；辣根过氧化物酶标记的马抗小鼠 IgG（美国Cell Signaling Technology，#7076）；DAPI溶液（北京索莱宝）；Alexa Fluor®594标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金桥）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测细胞活力 将细胞按5×103个/孔接种于96孔培养板，实验组加入不同浓度的KPT-8602，对照组加入与实验组等体积的完全培养液，每组设3个复孔；分别培养20、44、68 h 后，在每孔各加入10 μL CCK-8试剂，37℃孵育4 h，测D450nm值。按公式计算细胞的存活率：细胞的存活率=（D实验孔-D空白孔）/（D对照孔-D空白孔）×100%。

1.2.2 PI单染法检测细胞周期 将U937细胞按2×105个/孔接种于6孔培养板，实验组加入不同浓度的KPT-8602，使其终浓度为10、100、200 nmol/L，对照组加入与实验组等体积的完全培养液。培养48 h后200×g离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤1次，用70%的冰乙醇4℃固定过夜。PBS洗涤1次，弃去上清液，细胞沉淀加50 μL RNA酶，450 μL PI染色液，上机检测。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡将U937细胞按2×105个/孔接种于6孔培养板，实验组加入不同浓度的KPT-8602，使其终浓度为100、200、1 000 nmol/L，对照组加入与实验组等体积的完全培养液。培养48 h后收集细胞，PBS洗涤1次，用试剂盒专用结合缓冲液重悬细胞，实验组加入FITC标记的AnnexinV试剂5 μL，室温避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色混匀，上机检测。

1.2.4 Western blot 将U937细胞按2×105个/孔接种于6孔培养板，实验组加入不同浓度的KPT-8602，使其终浓度为10、100、200、1 000 nmol/L，对照组加入与实验组等体积的完全培养液。培养48 h后收集细胞，洗涤、裂解细胞，提取细胞总蛋白或胞核蛋白及胞浆蛋白。用BCA法测定蛋白浓度后每孔按30 μg蛋白上样。将蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转移至PVDF膜上，用含5%BSA的TBST溶液室温封闭1 h，加入相应的一抗4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入相应的HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL化学发光成像。GAPDH作为总蛋白及胞浆蛋白的内参蛋白，Lamin B1作为胞核蛋白的内参蛋白。

1.2.5 细胞免疫荧光检测XPO1亚细胞定位 将U937细胞按2×105个/孔接种于6孔培养板，实验组加入不同浓度的KPT-8602，使其终浓度为100、200 nmol/L，对照组加入与实验组等体积的完全培养液。培养48 h后收集细胞，PBS洗涤1次，加入40 g/L多聚甲醛溶液，室温固定10 min。将细胞悬液涂在防脱载玻片上，60℃烘烤玻片直至干燥，PBS洗3次。0.3%Triton-100溶液破膜15 min，PBS洗3次。避光滴加PBS稀释的荧光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次。避光滴加DAPI溶液，37℃避光孵育5 min，PBS洗3次，滴加少量防淬灭剂后盖上干净盖玻片，在荧光显微镜下观察，拍照。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（±s）描述。两独立样本均数的比较用t检验，多个样本均数的比较用单因素或多因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验进行多重比较，统计前经方差齐性检验，不满足方差齐性的多个样本均数的比较用Kruskal-Willis秩和检验。相关性分析采用Spearman秩相关。检验水准定为α=0.05。

2 结果

2.1 U937细胞XPO1蛋白表达水平高于正常人PBMC

应用Western blot法检测正常人PBMC、U937细胞株XPO1蛋白表达，结果显示与正常人PBMC相比，U937细胞的XPO1表达明显增高（P＜0.001，图1）。

2.2 KPT-8602抑制U937细胞的活力

用CCK-8法检测细胞活力，分析不同浓度KPT-8602作用不同时间对细胞活力的影响。结果显示：KPT-8602对正常人PBMC的生长基本无明显的影响，KPT-8602可抑制U937细胞的活力，药物浓度越大，细胞活力越低（F=41.420，P＜0.001）；随着作用时间的延长，细胞活力越低（F=17.554，P＜0.001）；时间和药物浓度两因素存在交互效应（F=1614.574，P＜0.001；图2）；KPT-8602 作用U937细胞后，24、48、72 h的IC50分别为（280±14）、（123 ± 5）、（84 ± 6）nmol/L。

2.3 KPT-8602使U937细胞周期阻滞在G1期

流式细胞仪检测显示，不同浓度KPT-8602处理U937细胞48 h后，各组细胞周期停滞在G1期的比例增加，组间差异有统计学意义（F=26.232，P＜0.001；图3），且随着药物浓度的增加，G1期所占百分比逐渐增多（r=0.935；P＜0.001）。提示KPT-8602对U937细胞有周期阻滞作用，可使细胞周期阻滞于G1期。

图1 正常人PBMC、U937细胞XPO1蛋白表达水平Fig.1 The expression of XPO1 in PBMC and U937 cells

图3 KPT-8602使U937细胞周期阻滞在G1期Fig.3 KPT-8602 blocked the cell cycle of U937 cells at G1 phase

图2 KPT-8602抑制U937细胞的活力Fig.2 The cell viability inhibition of KPT-8602 on U937 cells

2.4 KPT-8602促进U937细胞凋亡

流式细胞仪检测显示，不同浓度KPT-8602作用U937细胞48 h后，细胞凋亡率增加，组间差异有统计学意义（χ2=10.385，P=0.016，图4），且随着药物浓度的增加，凋亡率增加更加明显（r=0.972；P＜0.001）。表明KPT-8602能促进U937细胞凋亡，且随着药物浓度增加，促凋亡作用越明显。

2.5 KPT-8602抑制U937细胞XPO1蛋白表达

图4 KPT-8602促进U937细胞凋亡Fig.4 KPT-8602 promotes apoptosis of U937

2.5.1 Western blot 不同浓度KPT-8602作用U937细胞48 h后，XPO1蛋白的表达下降，组间差异有统计学意义（χ2=13.127，P=0.011；图5），且随着药物浓度的增加，XPO1蛋白的表达下降更明显（r=-0.964，P＜0.001）。表明KPT-8602作为XPO1的抑制剂，可以抑制XPO1在U937细胞的表达。

2.5.2 细胞免疫荧光 图6为荧光显微镜下观察各组细胞XPO1蛋白的表达情况，可以看到，XPO1在胞浆胞核中均有表达，KPT-8602作用U937细胞48 h后，XPO1在胞浆胞核中的表达均下降。

2.6 KPT-8602促进U937细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达

流式细胞术结果显示，KPT-8602可以诱导细胞凋亡，因此我们用Western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白的表达变化，结果显示不同浓度KPT-8602作用U937细胞48 h后，Cleaved Caspase-3蛋白的表达增加（r=0.986，P＜0.001），组间差异有统计学意义（χ2=13.597，P=0.009；图7）。

2.7 KPT-8602抑制U937细胞p-AKT蛋白表达

Western blot检测KPT-8602处理U937细胞后p-AKT蛋白的表达，结果显示不同浓度KPT-8602作用U937细胞48 h后，AKT的磷酸化水平降低（r=-0.964，P＜0.001），组间差异有统计学意义（χ2=13.127，P=0.011；图8）。

图5 KPT-8602抑制U937细胞XPO1的表达Fig.5 KPT-8602 inhibits the expression of XPO1 in U937 cells

2.8 KPT-8602处理U937细胞后胞核及胞浆蛋白的表达

图6 荧光显微镜观察U937细胞XPO1的表达情况（400×）Fig.6 XPO1 expression of U937 cells after treatment with KPT-8602 for 48 h by fluorescence microscopy（400×）

图7 KPT-8602处理U937细胞后Cleaved Caspase-3的表达Fig.7 The expression of Cleaved Caspase-3 in U937 cells after treatment with KPT-8602

图8 KPT-8602处理U937细胞后p-AKT的表达Fig.8 The expression of p-AKT in U937 cells after treatment with KPT-8602

图9 KPT-8602处理U937细胞后XPO1、p21蛋白的表达Fig.9 The expression of XPO1 and p21 in U937 cells after treatment with KPT-8602

核浆分离Western blot检测KPT-8602处理U937细胞后胞核及胞浆XPO1、p21蛋白的变化，结果显示不同浓度KPT-8602作用U937细胞48 h后，胞核及胞浆的XPO1蛋白的表达均下降，胞核及胞浆的p21蛋白的表达均升高（图9）。

3 讨论

蛋白质的错误定位或者异常调节将导致各种疾病的产生，包括癌症、炎症、自身免疫性疾病等，胞核与胞浆转运系统调节肿瘤抑制蛋白的亚细胞定位［11］，XPO1在多种侵袭性肿瘤中都有高表达，并且XPO1在多种恶性肿瘤中的过表达与预后不良密切相关［12-15］，因此XPO1有希望成为肿瘤治疗的靶点。

XPO1通过依赖Ran-GTP的机制发挥作用，货物蛋白结合XPO1后，在核内与Ran-GTP三者形成三聚体，通过核孔复合物转运至胞浆。在胞浆中，Ran-GTP水解为Ran-GDP，货物蛋白与XPO1的亲和性减弱，从而在胞浆中释放。XPO1和Ran-GDP再返回核内循环利用［16］。在卵巢肿瘤中，胞浆XPO1增强与更晚的分期，分化差和较高有丝分裂率有关［17］。在食管肿瘤中，免疫组化也显示XPO1的定位发生了改变，从在正常组织中胞核表达转变为在癌组织中胞核和胞浆表达［18］。XPO1在不同肿瘤中亚细胞定位并不总是一致。本实验中我们发现与正常人PBMC相比，U937细胞的XPO1表达明显增高，Western blot和免疫荧光的结果均显示，KPT-8602作用U937细胞后，XPO1蛋白在胞浆胞核中的表达均下降。

KPT-8602处理U937细胞后，CCK-8结果显示KPT-8602抑制U937细胞的活力，72 h的IC50为（83.82±6.021）nmol/L。KPT-8602是新型的核输出选择性抑制剂（selective inhibitors of nuclear export，SINE），SINE选择性抑制XPO1，特异性结合XPO1的反应位点Cys528残基，使货物蛋白保留在胞核里［19-20］，从而抑制肿瘤细胞增殖。本实验还发现同浓度KPT-8602对正常人PBMC的生长基本无明显的影响，既往也有研究显示10 mmol/L KPT-8602对正常人PBMC无明显影响［21］。

p21是细胞周期蛋白依赖性激酶的重要成员之一，负调节细胞周期过程，是肿瘤抑制蛋白。XPO1可以识别和转运富含亮氨酸的核输出信号（nuclear export signal，NES）的货物蛋白，包括转录因子和肿瘤抑制蛋白，如p53、p21、p27、FOXO。有研究表明XPO1抑制剂S109可下调肾癌细胞Cyclin D1的表达，诱导FOXO1和p21的核积累，从而阻碍细胞周期［22］。与既往研究一致，我们发现KPT-8602能将细胞周期阻滞在G1期，KPT-8602处理U937细胞后，细胞周期抑制蛋白p21在胞核和胞浆中的表达均升高。说明XPO1抑制剂对肿瘤抑制蛋白的影响可能导致细胞增殖抑制、细胞周期阻滞。

我们发现KPT-8602作用U937细胞后，细胞凋亡率增加，凋亡蛋白Cleaved Caspase-3蛋白的表达增加，表明KPT-8602通过活化Caspase家族促进细胞凋亡。有研究表明SINE对多种肿瘤细胞具有抑制增殖的作用都与诱导细胞凋亡有关［23］，与本次研究结果一致。

在本研究中，KPT-8602抑制U937细胞p-AKT的表达，表明可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路，从而抑制细胞增殖，阻滞细胞周期及促进细胞凋亡。PI3K/AKT信号转导通路是细胞生存的重要通路之一，在许多肿瘤中异常激活［24］，针对该途径的多种小分子抑制剂已被开发作为癌症疗法［25］。AKT是PI3K/AKT信号通路的关键分子，PI3K的活化使AKT发生磷酸化而激活，活化的AKT通过影响下游多种效应分子的活化状态而发挥作用，活化的AKT能够调节细胞增殖及周期相关的蛋白p21和p27，进而影响细胞增殖［26］。PI3K/AKT信号转导通路可调控多个与细胞凋亡有关的蛋白或家族，如FOXO、Bcl-2家族及Caspase-9和细胞凋亡抑制蛋白等，从而调控细胞凋亡［27］。

总而言之，新一代XPO1抑制剂KPT-8602可使U937细胞活力下降，使细胞周期阻滞于G1期，诱导细胞凋亡，其机制可能与下调XPO1表达，抑制PI3K/AKT通路有关。我们的研究结果支持了KPT-8602作为NHL患者的新型治疗策略具有一定的前景，KPT-8602与其他抗肿瘤药物联合使用的效果如何，仍需进一步的体外和体内实验或临床试验来验证。