李 倩，尹恬恬，胡宇辰，吴 景，张 敏，何 杰，

（1.安徽医科大学附属省立医院//中国科学技术大学附属第一医院，安徽合肥230031；2.中国科学技术大学附属第一医院西区//安徽省肿瘤医院，安徽合肥230031）

胶质瘤是大脑中最常见的原发性肿瘤，而胶质母细胞瘤是其恶性度最高的组织学类型。胶质母细胞瘤细胞自身较强的增殖能力和侵袭性是其成功治疗的主要障碍。目前临床采用手术、放疗、化疗和生物治疗等综合治疗手段，但患者生存期改善不明显，预后仍很差，中位生存期14月左右［1］。目前研究认为，寻求特异性针对胶质母细胞瘤增殖和侵袭机制的治疗方案，将有可能遏制肿瘤的生长。近年相关研究发现，LncRNA在多种肿瘤中存在显著的表达改变，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移、自噬及化疗敏感性等生物学行为的调节，在肿瘤的发生进展中发挥重要作用［2］，有可能成为在胶质母细胞瘤侵袭、预后的分子标记物，将为临床肿瘤的靶向治疗提供依据。肝癌高表达转录本（highly up-reglated in 1iver cancer，HULC）是LncRNA的一种，被发现在多种恶性肿瘤中表达上调［3-4］，但在胶质母细胞瘤中表达状况的报道甚少。本研究为了证实HULC在胶质母细胞瘤细胞中的表达及对胶质母细胞瘤生长的影响，以沉默表达HULC的胶质母细胞瘤细胞株SHG44为研究对象，采用CCK8、平板克隆、细胞周期及细胞凋亡等实验探讨LncRNA HULC沉默表达对胶质母细胞瘤细胞株SHG44增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人脑胶质母细胞瘤细胞株SHG44（中国典型培养物保藏中心，中国），胎牛血清和DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，美国），NC、HULC-siRNA（上海吉玛制药技术有限公司，中国），细胞增殖毒性检测试剂盒（合肥新恩源生物技术有限公司，中国），吉姆萨染液（合肥新恩源生物技术有限公司，中国），Annexin V-488凋亡试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国），总RNA提取试剂盒（QIAGEN，德国），cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃，50 mL/L CO2恒温培养箱中培养，取对数生长期SHG44细胞，通过针对基因HULC的慢病毒干扰载体构建、慢病毒包装、病毒侵染、致死浓度及稳筛株构建，获得稳定转染的实验组细胞株，即转染HULC抑制剂的SHG44细胞为HULC干扰组（HULC-siRNA），转染HULC抑制剂空白载体SHG44细胞为HULC干扰组的阴性对照组（NC），将实验组细胞置于37℃，50 mL/L CO2恒温细胞培养箱中培养48 h后传代收集对数生长期细胞进行相应检测。

1.2.2 qRT-PCR实验 消化收集细胞，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，然后按照cDNA逆转录试剂盒说明书制备cDNA反应程序：42℃30 min；85℃10 min。再运行qRT-PCR反应程序：95℃，变性3 min，40个扩增循环（95℃12 s，62 ℃ 40 s）。 HULC 引 物 上 游 序 列 ：5′-TCAACCTCCAGAACTGTGATCC-3′，下游序列：5′-TGCTTGATGCTTTGGTCTGTT-3′。以 ACTB 为内参，ACTB引物上游序列：5′-CGTGGACATCCG CAAAGA-3′，下 游 序 列 ：5′-GAAGGTGGACAG CGAGGC-3’。以 2-ΔΔCt计算 HULC mRNA 的相对表达量。实验重复三次，并用GraghPad Prism 5软件分析结果。

1.2.3 CCK8增殖实验 消化收集对数生长期的各组细胞，离心重悬后计数，调整浓度约2.0×104细胞/mL；准备4块96孔板，向每孔加入100 μL细胞悬液（每孔含2 000个细胞），每组细胞设6个复孔；在细胞样本孔周围一圈每孔加入200 μL PBS溶液，置于37℃，50 mL/L CO2恒温细胞培养箱培养。次日，待细胞贴壁后取出第一块96孔板，弃去原培养基，每孔加入100 μL 100 mL/L CCK8液（将CCK8母液用完全培养基做10倍稀释使用），置培养箱中孵育2 h后上酶标仪检测450 nm处的吸光度值（OD值），此为24 h OD值，其余各板每孔补加完全培养基 100 μL，并依次在 48 h、72 h 和96 h以同样的方法检测相应的OD值。实验重复三次，并用GraghPad Prism 5制作各组细胞上述四个时间点的生长曲线。

1.2.4 平板克隆形成实验 消化收集对数生长期的各组细胞，离心重悬后计数，以每孔300个细胞接种6孔板，每组细胞设3个复孔；每3～5 d换液，约10～12 d终止培养，40 mL/L多聚甲醛溶液固定30 min，吉姆萨染液染色8 min，清水洗去染液后晾干，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。克隆形成率（%）＝克隆数/实际接种细胞数×100%。实验重复3次，并用GraghPad Prism 5软件分析结果。

1.2.5 细胞周期实验 消化收集对数生长期的各组细胞，用预冷的PBS漂洗2次，加入500 μL PBS重悬后缓慢加入到5 mL 700 mL/L预冷乙醇中，于4℃固定过夜；次日取出固定后的细胞，以1000 r/min（r=6 cm）的速度离心3 min，弃去上清，用PBS轻柔漂洗1次，并用500 μL PBS重悬细胞，然后加入 10 μL RNase A（10 mg/mL），轻柔混匀后置于37℃温箱孵育30 min，取出细胞并加入5 μL PI（100 μg/mL）染液，室温避光孵育15 min，立即进行流式细胞仪检测细胞周期分布情况。实验重复3次，并用FlowJo 7.6.1和GraphPad Prism 5软件分析结果。

1.2.6 细胞凋亡实验 用不含EDTA的胰酶消化、离心收集各组细胞，调整细胞终浓度为1×106/mL，预冷PBS漂洗2次，向细胞中加入100 μL钙离子缓冲液轻柔吹打混匀制成单细胞悬液，先后加入5 μL Annexin V-488染液和5 μL PI染液，注意设置Annexin V-488和PI单染组和无染液的空白对照组，轻柔混匀，室温避光孵育15 min，再加入500 μL钙离子缓冲液重悬细胞，轻柔混匀后立即进行流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。实验重复3次，用FlowJo 7.6.1和GraghPad Prism 5软件分析结果。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差表示，采用SPSS 22.0统计软件分析数据，两组均数比较采用两独立样本均数的t检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HULC沉默表达效果鉴定

将HULC抑制剂（HULC-siRNA组）及抑制剂空白载体（NC组）转染SHG44细胞后，采用qRTPCR检测HULC的表达，与NC组相比，转染HULC-siRNA组的HULC表达水平显著减少（图1），差异有统计学意义（t=6.616，P=0.003），说明实验组细胞建立成功。

图1 SHG44细胞的HULC沉默表达稳转细胞系表达水平验证Fig.1 Verification of expression levels of HULC-silenced stably transfected cell lines in SHG44 cells

2.2 沉默表达HULC抑制SHG44增殖、促进其凋亡

CCK8增殖实验显示实验第2、3、4天HULC-siRNA组细胞OD450值明显低于NC组（图2A）；平板克隆形成实验显示NC组和HULC-siRNA组的克隆形成率分别为（34.11±1.24）%和（14.44±0.87）%，沉默表达HULC细胞克隆形成率显著降低（图2B）；细胞周期实验显示NC组和HULC-siRNA组的细胞数分别为：G1期（36.89±4.09、51.74 ± 0.68），S期（46.95 ± 2.49、36.89 ± 2.13），沉默表达HULC细胞周期被阻滞G1/S期（图2C）；细胞凋亡实验显示NC组和HULC-siRNA组的早期凋亡率分别为（2.57±0.22）%和（7.06±0.71）%，沉默表达HULC细胞早期凋亡率显著增加（图2D）。上述实验差异均具有统计学意义（图2A：第2天：t=6.616，P=0.003，第3天：t=19.93，P=0.005，第4天：t=31.41，P=0.009；图2B：t=13.01，P＜0.001；图 2C：G1期 t=3.577，P=0.023，S期 t=3.063，P=0.038；图2D：t=6.045，P=0.004），说明HULC 沉默表达后可抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、阻滞细胞周期进展并促进其凋亡。

3 讨论

LncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码调控RNA，主要通过与其他分子（如蛋白质，DNA，RNA和金属离子）相互作用以形成适当的三级结构来发挥生物学功能。LncRNA影响各种生物学过程的基本分子机制，包括染色质组织、表观遗传调控、基因转录和翻译、RNA转换和基因组防御等［5-7］。目前很多LncRNA被证实在多种肿瘤中存在显著的表达改变，并参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移、自噬及化疗敏感性等恶性生物学行为的调节。LncRNA HULC位于人类基因组6p24.3，于2007年通过芯片筛查在肝癌中发现并命名［3］。但随后被大量文献陆续报道在胃癌、结直肠癌、胰腺癌、骨肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等肿瘤中均有特异性高表达。文献指出，HULC不仅在上述肿瘤的组织和细胞系中表达水平升高，而且与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、患者预后及生存期等都呈显著正相关［3-4，8-11］。如Jin等［12］发现HULC在胃癌血清中的过表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期和幽门螺杆菌感染有关。Peng等［8］使用qRT-PCR发现HULC在DLBCL组织和细胞系中均显著过表达，且与DLBCL的Ann Arbor分期、B症状（发热、盗汗、体质量减轻）、CHOP方案治疗、利妥昔单抗治疗和国际预后指数（IPI）等密切相关。同时，有学者还指出，HULC的敲低可抑制肿瘤细胞的致瘤性［11］。如Uzan等［10］研究发现HULC在骨肉瘤（OS）组织和细胞系中与正常对照相比显著上调，他们通过用小干扰RNA抑制HULC的表达进行功能实验，显示细胞的增殖、迁移和侵袭能力都明显受抑制。但HULC在胶质母细胞瘤中的表达情况目前报道甚少，我们课题组前期实验通过qRT-PCR发现人脑胶质母细胞瘤组织中HULC的表达水平明显高于瘤旁组织，胶质母细胞瘤细胞中HULC高表达，并应用胶质母细胞瘤细胞株U87进行细胞功能实验得出HULC过表达促进细胞增殖、迁移和侵袭能力的结论［11］。本实验通过向胶质母细胞瘤细胞SHG44中转染HULC抑制剂并以qRT-PCR验证其表达被沉默，行功能实验发现SHG44细胞的生长和增殖受到抑制，显示HULC扮演着促癌基因的角色，促进癌细胞的增殖、侵袭和转移，抑制癌细胞凋亡。

众所周知，肿瘤是一种多基因疾病，其特征在于细胞生长的不受控制、细胞周期的失调以及对细胞凋亡的抵抗性。肿瘤细胞的命运取决于某些关键分子的表达，包括肿瘤抑制因子，致癌基因以及细胞周期调节因子等。HULC作为促癌基因已在多种类型肿瘤中得到证实，对于其机制的研究在多种类型肿瘤中也具有多样性。如在鼻咽癌中有学者发现沉默HULC表达后癌细胞周期被阻滞在G1期并促进细胞凋亡［13］，机制是HULC的敲低触发了p53的活化并诱导了p21的基因表达，p53和p21的表达被激活后引发了鼻咽癌细胞的细胞周期停滞和细胞凋亡，指出沉默HULC表达后可通过激活p53-p21途径显著抑制鼻咽癌细胞的增殖能力。Li等［14］等研究发现HULC和YB-1的亚细胞共定位，YB-1是被认为是一种癌蛋白，调节多种增殖途径，超越细胞周期检查点，并促进基因组不稳定性、血管生成和转移。所以他们指出HULC在肝癌中的促癌机制是与YB-1蛋白特异性结合并通过细胞外信号调节激酶（ERK）加速其磷酸化，导致YB-1从YB1-mRNA复合物中释放并促进沉默mRNA的翻译包括细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E1和基质金属蛋白酶3（MMP3）。此外，他们的研究还显示HULC可抑制顺铂诱导的细胞凋亡。目前在HULC对胶质母细胞瘤方面的机制研究也有报道，有学者认为HULC通过调节作为Skp-1/2靶标的细胞周期蛋白A/D1/E、p-Rb、c-Myc、CDK2/4和p16/p21/27的表达来诱导肿瘤增殖、迁移和细胞周期进展，以及通过调节Bcl-2/Bax和caspase-3/8的表达来诱导肿瘤失巢凋亡抵抗抑制细胞凋亡［15］。本实验发现沉默表达HULC后SHG44的G1期明显延长，阻断了有丝分裂中的细胞，表明HULC通过促进G1/S转换增强细胞增殖，另外沉默表达HULC后SHG44细胞早期凋亡率升高，表明HULC促进细胞凋亡。我们认为HULC可能通过调控PI3K/AKT信号通路阻断细胞周期G1/S期并诱导失巢凋亡，从而影响胶质母细胞瘤细胞生物学行为，有待下一步机制实验验证。

图2 不同处理组SHG44细胞的增殖、周期分布及凋亡情况Fig.2 Proliferation，cycle distribution and apoptosis of SHG44 cells in different treatment groups

综上所述，本实验对HULC的初步了解提示HULC在胶质瘤的发展中起着重要的作用，可能是会作为肿瘤的治疗靶点和预后标志物，为广大临床肿瘤患者的诊治带来福音，但目前研究尚浅。后期我们将进一步进行体内、体外研究，探讨HULC对胶质瘤生物学行为的调控机制，为胶质母细胞瘤的临床治疗提供理论依据。