宋月

摘 要：本次试验所使用的图样主要由鸡场周围环境中采集，利用伊红美蓝培养基平板实现对大肠杆菌的分离纯化。然后将其作为宿主针对相应的噬菌体进行研究。通过结果发现我们共分离到4株大肠杆菌，经过鉴定后其在埃希氏大肠杆菌涵盖范围之内。主要有多面体头部以及尾部共同组成，这是利用负染经电镜观察所取得的结果。在人工胃液条件的影响下即会死亡，通过对其生长曲线进行测定后发现裂解能力相当强。因此，在鸡舍环境治理中该噬菌体所起到的应用价值就高。

關键词：大肠杆菌；噬菌体；生物学特性

畜禽机体以及养殖环境事大肠杆菌分布的主要位置。致病性以及非致病性是大肠杆菌的两种主要形式。幼雏畜禽腹泻以及土壤与水体污染等都会在一定程度上受到大肠杆菌的影响。在预防大肠杆菌过程当中我们可通过对幼雏动物进行疫苗接种的方式进行。物理法与化学法是传统环境消毒所使用的方法，但是这种方法存在一定的缺陷，还会造成二次污染环境的问题出现。因此，现阶段我们面对的主要问题就是实现对靶向特异杀菌以及长期持续作用生物消毒剂的寻找。

一、材料与方法

1.材料

（1）菌种与样品

E.coli078、E.coli2116、E.coli25922均由山东大学微生物技术国家重点实验室提供。污水及粪便样品来源于泰安市郊区养鸡基地。

（2）培养基及试剂LB培养基

蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，去离子水1000ml，pH7.0，121℃20min高压灭菌；人工胃液（pH1.2）：NaCl2g，HCI（12mol/L）7mL，超净水1000mL，胃蛋白酶3.2g，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

2.方法

（1）大肠杆菌的分离纯化及鉴定

将鸡场采集的样品于EMB平板上反复划线，直至得到大小、形态均一的具金属光泽的单菌落，进行镜检。进一步采用DNA试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16SrDNA序列扩增，所用引物为通用引物。

（2）大肠杆茵噬菌体的分离纯化

取样品1g加到5mLLB液体培养基中振荡培养1h，释放噬菌体；取500μL，对数期宿主菌液加入到上述溶液中，振荡培养过夜，6000r/min离心5min，上清液为噬菌体裂解液。采用Adams双层平板法，取200μL对数期的宿主菌液与适当稀释的100μL噬菌体液混合于4.5mL上层半固培养基中，倒入已铺好的水琼脂平板上，置于37℃培养箱中培养12h，根据所形成的噬菌斑的形态，依据上述方法反复纯化，直至得到形态大小均一的噬菌斑。

二、结果与分析

1.噬茵体的分离纯化及形态观察结果

将分离出的4株大肠杆菌作为宿主菌实现对噬菌体的相应分离，分离范围为鸡场样品。当E.coliLY4作为宿主存在使我们可实现对一株烈性噬菌体的获取。对其进行纯化后直径可达到2.5-3.8mm，裂解性相当清晰。通过电镜对噬菌体进行观察后发现具备头部多面体，直径大概维持在70-90mm之间，尾部长度最高可达到200mm，有较为清晰的颈部存在于头部与尾部之间，可以说在蝌蚪状的可收缩尾的噬菌体涵盖范围之内，我们将其命名为φLY4。在测定噬菌体效价过程当中需要使用Adams双层平板法。

2.噬菌体pH、热稳定性分析

噬菌体垂LY4对pH的适应范围较广，在pH5.0～10.0仍能保持较高活性，效价在109左右；pH4.0时，活性开始下降，对pH4.0以下的酸性环境耐受性低于对碱性环境的耐受性；噬菌体φLY4在-20、4、18和37℃保温100min后，效价变化均在一个数量级范围内，且能保持较高的活性，效价在109左右；在60℃作用下，活性丧失较明显，效价下降到107左右；因此，该噬菌体在-20～37℃之间能保持较好的稳定性。

三、讨论

通过上述分析可以发现，机场周围的土壤与环境有大量大肠杆菌噬菌体分布。这不仅可实现对病原菌的有效清除，同时对环境恶臭的改善也有较为积极的作用。在分析鸡场土样过程当中可实现对噬菌体φLY4的获取，其主要组成部分为多面体头部以及尾部，在裂解活性方面占据相当强的优势。2.5-3.8mm是噬菌斑直径大概范围，潜伏期以及裂解期较短是其明显特征。在较短的时间内即可实现对宿主细胞的有效杀死，该种特性的应用价值相当高。本次研究速度是来源不同的大肠杆菌。在此基础上针对宿主范围进行测定，证实其专一性较为严格，所以在使用过程当中会受到一定程度的限制。通过研究可以发泄。广谱噬菌体可通过人工改造技术实现对噬菌体宿主谱的逐步发展，或者将其改造为定向宿主。这不仅可促使其应用潜力得到改善，同时对环境的进一步发展有重要作用。

在对噬菌体对温度及PH进行确定时我们需要借助生物活性对其进行测定，取得结果证明其范围较宽。在温度维持在-20-37℃时，宿主菌的感染性相当强，温度逐步升高其活性会逐步减弱，直至60°C完全消失，这为噬菌体制剂研制以及加工工作的顺利开展打下坚实基础。注意在针对田间环境进行推测时，我们可利用排除温度的方法对其影响进行进一步分析。其较高的活性需要将PH值维持在5.0-10.0之间，相对于酸的耐受性来说，该种噬菌体对碱的耐受性明显较高。导致上述现象出现的原因有很多种，大肠杆菌几乎在中性或者偏碱性环境中进行生存就是其中之一。宿主菌在酸性条件下生长会受到一定的抑制，因此破坏到噬菌体的一系列生长与繁殖，所以噬菌体效价长期得不到有效提升，严重时会出现死亡现象。在处理事君体的过程当中，如果使用人工胃液会直接导致其死亡，这与不耐酸结果之间呈现出一种相契合的状态。在此基础上可以推测出该种噬菌体不适合口服。尤其是畜禽不会因为误食该种是菌体而导致体内的微生态平衡被破坏。

结语：噬菌体在生存过程当中主要是依附细菌，其繁殖与裂解也需要借助细菌宿主来完成，现阶段作为一种传统的化学治疗逐步引起社会各界的广泛关注。大肠杆菌对畜牧养殖有相当大的危害，土壤以及水体是大肠杆菌分布的主要范围，如果能利用噬菌体实现对生物消毒剂的制作，即可在处禽养殖环境污染方面起到不可替代的重要作用。但是我们需要借助必要的措施与手段实现对杀菌范围的不断提高，尤其是要在合理应用试菌体变异等问题的基础上，改善养殖环境。

参考文献

[1]王冉，韩晗，张辉，等.大肠杆菌K88噬菌体的分离鉴定及其生物学特性[J].华北农学报，2012，27（4）：163-167.

[2]王礼伟，梁晏，屈勇刚，等.一株鸡源致病性大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性[J].江苏农业学报，2014，30（2）：455-457.