张芳芳，刘 飞，袁 超，高 亮，王 羽，凌沛学,, 朱希强*

（1. 山东大学药学院，山东 济南 250012；2. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室 博士后科研工作站，山东 济南 250101；3. 山东省商业集团有限公司，山东 济南 250014；4. 山东农业工程学院 环境科学与工程学院，山东 济南 250100）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum），又称金花菌，是散囊菌目发菌科散囊菌属的一类真菌。该菌是茯砖茶生产加工过程中的优势菌，是形成茯砖茶独特品质的关键因素[1]。目前冠突散囊菌发花优劣已作为判断茯砖茶品质的理化指标，列于国家标准。有研究表明冠突散囊菌有调节血脂血糖[2-4]，改善人体肠道功能[5-7]，抗氧化[8-9]作用。在茯砖茶发花过程中，冠突散囊菌大量生长，其它微生物则受到抑制，提示冠突散囊菌在生长过程中产生了具有抑菌活性的物质。目前已证实冠突散囊菌发酵液有一定抑菌作用[10]，但对冠突散囊菌抑菌产物的性质研究较少。本实验采用几种常用有机溶剂提取发酵液中的抑菌活性物质，从而确定发酵液中抑菌物质的极性分布范围，为天然抗菌素的开发和利用提供参考。

1 材料

1.1 菌种

冠突散囊菌分离自湖南惟楚福瑞达生物科技有限公司所产黑茶[11]。藤黄微球菌（Micrococcus luteus），大肠杆菌 （Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），白色念珠菌（Candida albicans），白色链霉菌（Streptomyces albus）均由山东省药学科学院生物技术中心提供。

1.2 培养基及试剂

冠突散囊菌种子培养基为YEPD培养基（g/L）：葡萄糖20.0，酵母粉10.0，胰蛋白胨20.0，固体培养基含1.5 %琼脂粉；发酵培养基（g/L）：茶粉6.0，葡萄糖20.0，酵母粉5.0，NaH2PO4·2H2O 1.2，K2HPO4·3H2O 3.0，MgCl2·6H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.01，pH值自然。

藤黄微球菌，大肠杆菌采用LB培养基（g/L）：酵母粉5.0, 胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0；培养白色念珠菌使用YEPD培养基；培养白色链霉菌使用YMG培养基（g/L）：酵母粉4.0，麦芽提取物10.0，葡萄糖4.0，固体培养基含1.5 %琼脂粉。以上培养基均115 ℃，30 min高压灭菌后备用。无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯与正丁醇为分析纯试剂。

1.3 仪器

HPS-20恒温生化培养箱（哈尔滨东联）、Multitron通用型震荡培养箱（伊浮森）、HD-1360洁净工作台（北京东联哈尔）、RE-52旋转蒸发器（上海亚荣）、SHZ-D循环水式真空泵（巩义予华）、TW12恒温水浴锅（JULABO）、SCIENTZ-1 8 N 冷冻干燥机（宁波新芝）、S O RVA L L RC-6PLUS高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific）。

2 方法

2.1 供试菌的培养

在相应的固体培养基上划线培养供试菌，挑取单菌落在液体培养基中振荡培养，其中藤黄微球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌37 ℃过夜培养；白色念珠菌、白色链霉菌于30 ℃培养2～3 d，摇床转速均为220 r/min。使用无菌水将菌液配制成106～107CFU/ml的菌悬液，4 ℃冰箱保存待用。

2.2 冠突散囊菌发酵产物制备

将甘油保存的冠突散囊菌菌种在YEPD固体培养基上划线培养3 d，用刮刀刮取固体平板上的孢子于无菌水中混悬（108个/ml），按2 %接种到100 ml发酵培养基中，30 ℃，220 r/min摇床发酵培养5 d。将发酵液上清和菌丝体分离，发酵液上清加入乙醇至浓度为80 %，静置过夜以除掉蛋白，多糖等杂质，醇沉后上清浓缩至一定体积，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，各提取3遍后合并提取液，减压浓缩至浸膏，4 ℃保存待用。

2.3 抑菌活性检测

在无菌条件下分别吸取100 µl活化后的供试菌菌悬液，加入100 ml熔化冷却的培养基中，混合均匀后倒入一次性平板，在冰箱中活化2 h后，用无菌打孔器在各平板上打孔。将各待测液用DMSO配制成50 mg/ml的溶液，吸取50 μl无菌滤膜过滤的各样品溶液置于培养基小孔中。待样品完全扩散入培养基后，将各平板倒置于恒温培养箱中培养。藤黄微球菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌放置于37 ℃培养箱中过夜，白色链霉菌和白色念珠菌放置于30℃恒温培养箱中48 h，以DMSO为阴性对照，测量各抑菌圈的大小，每组平行测定3次。

2.4 抑菌作用热稳定性

取适量乙酸乙酯提取物，平均分成4组，分别在40，60，80，100，121 ℃温度下处理30 min，冷却至室温后，以未处理的乙酸乙酯相提取物为对照，以抑菌效果明显的枯草芽孢杆菌为指示菌，用打孔法测定各处理液的抑菌活性，每个处理重复3次，将平板置于37 ℃过夜培养后测量抑菌圈直径。

2.5 抑菌作用酸碱稳定性

取适量乙酸乙酯提取物，采用1 mol/L 盐酸溶液和1 mol/L 氢氧化钠溶液分别调pH至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，放置2 h，以未处理的样品为对照，以枯草芽孢杆菌为供试菌，进行抑菌活性检测，每个处理重复3次，将平板置于37 ℃过夜培养后测量抑菌圈直径。

3 结果

3.1 抑菌活性

冠突散囊菌不同溶剂提取相对细菌、真菌、放线菌的抑菌作用见表1。

表1 发酵液各提取相对供试菌的抑菌圈直径

结果表明，发酵液对枯草芽孢杆菌、白色链霉菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌、白色念珠菌的抑制作用不明显。发酵液各提取相的抑菌作用显示，抑菌活性物质主要集中在乙酸乙酯相中，证明抑菌活性物质具有与乙酸乙酯相似的极性。

3.2 抑菌作用热稳定性

发酵液乙酸乙酯提取物不同温度处理后的抑菌作用，见图1。

图1 温度对抑菌作用的影响

结果表明，随着温度升高（25～121 ℃），抑菌作用略有下降。抑菌圈直径的浮动范围为14.10～13.75 mm，可见抑菌物质具有良好的热稳定性。

3.3 抑菌作用酸碱稳定性

不同pH值下冠突散囊菌发酵液乙酸乙酯提取相的抑菌作用，见图2。

图2 酸碱处理对抑菌作用的影响

结果表明，抑菌作用在pH 4～8范围内浮动较小，在过酸或过碱的条件下抑菌作用变大，通过调整溶剂的pH值检测抑菌作用，结果表明，与溶剂本身的酸碱度有关，可见抑菌物质有良好的酸碱稳定性。

4 讨论

本文研究了冠突散囊菌发酵液不同溶剂提取物对细菌、真菌、放线菌的抑菌作用，发现乙酸乙酯提取相对革兰阳性菌、放线菌的抑制作用明显优于其它提取相，表明抑菌物质与乙酸乙酯有相似的极性，乙酸乙酯可有效地浓缩富集冠突散囊菌发酵液中的抑菌活性物质。研究还表明，抑菌物质有良好的热稳定性和酸碱稳定性，这是分离纯化冠突散囊菌发酵液中抑菌活性代谢产物的前提条件，有利于冠突散囊菌功能产品的应用性开发。