薛安琪，周冰谦，韩贝贝，韩婷婷，冯金红

（齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东 济南，250014）

牛蒡子苷元（arctigenin，ARG）是由中药牛蒡子中提取分离得到的木质素类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒等药理作用。现代药理学证明，牛蒡子苷元抗肿瘤活性表现为可抑制多种肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭和转移等。作用于不同的肿瘤细胞或在不同条件下，牛蒡子苷元的作用机制不同。有研究发现，牛蒡子苷元可通过影响脑胶质瘤相关蛋白（PCNA、GFAP）的表达及抑制 CD40 的表达来调节机体免疫，从而明显抑制脑胶质瘤生长[1]。另有研究报道，牛蒡子苷元可通过下调细胞中抗凋亡因子Bcl-2基因的表达而促进细胞凋亡[2]。前列腺癌为男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，据美国癌症协会2017年癌症调查报告显示，前列腺癌在男性所有肿瘤新发病例中占第1位[3]。在我国，前列腺癌同样为男性多发肿瘤，其发病率近年呈明显的上升趋势[4]，但对其缺乏安全有效的治疗措施。以人前列腺癌细胞模型研究牛蒡子苷元的抗肿瘤活性取得了初步进展，Wang等[5]发现，牛蒡子苷元可通过抑制前列腺癌LAPC-4细胞雄激素受体（AR）蛋白的表达而抑制其增殖，李孝庆等[6]发现牛蒡子苷元可诱导PC3细胞发生非凋亡性死亡，推测可能与诱导Bcl-2表达下调相关。牛蒡子苷元影响前列腺癌侵袭、迁移的研究较少，鉴于此，本研究对牛蒡子苷元对人前列腺癌PC3细胞侵袭、迁移的作用进行了观察，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TiSeries 倒置显微镜（日 本NIKON公司）；3 111 型细胞培养箱（美国Thermo公司）； D-37520 Osterode型低温大容量离心机（美国Thermo公司）；EnSpireTM多功能酶标仪（美国PE公司）；BBS-DDC型超净工作台（济南鑫贝西）；LightCycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（美国Roche公司）。

1.2 材料

人前列腺癌PC3细胞（中国科学院细胞库）；牛蒡子苷元固体（含量＞98 %，阿拉丁公司）；胎牛血清（购自美国 Gibco 公司）；RNAase 酶（北京索莱宝）；Matrigel基质胶（美国BD公司）；Transwell 24孔板和其他细胞培养板（美国Corning公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF），乙基苯基聚乙二醇 [Nonidet P-40（NP-40）]，Tris，EDTA，结晶紫（美国Sigma-Aldrich公司），其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养

将PC3细胞接种于RPMI-1640 培养基（添加10 %胎牛血清及青霉素、链霉素各100 U/ml），37 ℃、5 % CO2、饱和湿度条件下培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 MTT法检测ARG抗肿瘤活性

收集对数生长期的细胞，将细胞稀释，以5×103个/孔加入96孔板。待细胞贴壁后，加入不同浓度的牛蒡子苷元，使终浓度为100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56 μmol/L。37 ℃培养48 h后，每孔加入0.5 % MTT溶液至0.5 mg/ml，继续孵育4 h，然后弃去孔内液体，每孔加150 μl DMSO溶解，采用酶标仪于490 nm处测定OD值，利用Origin7.5软件拟合曲线，计算抑制细胞增殖活性IC50值。

2.3 Transwell法检测ARG对PC3细胞侵袭的影响

按照12:1的体积比用无血清的RPMI-1640 培养基稀释Matrigel，铺于Transwell小室（8.0 μm）的上室，置于培养箱中包被1 h后加入50 μl无血清RPMI-1640培养基水化基底膜30 min。将6孔板中加药孵育48 h的PC3细胞收集并计数，各小室分别加入1×105个PC3细胞及不同浓度药物至上室体积为200 μl，实验组加入2.5，10 μmol/L ARG，阴性对照组加入不含药物的培养基。下室也加入含相同药物浓度并含10 %血清的RPMI-1640培养基500 μl。12 h 后，取出小室，膜下表面的细胞用PBS 洗涤一次，晾干后用甲醇固定10 min，晾干，0.1 %结晶紫染色10 min。染色后的小室用PBS 洗3次，然后用棉球擦掉上室内未侵袭的细胞及基质胶，并晾干，显微镜下观察膜下表面的细胞并拍照。然后用33 %醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液采用酶标仪570 nm下测定OD值，计算抑制率。

2.4 划痕实验检测ARG对PC3细胞迁移的影响

将PC3细胞以1×105个/孔铺于24孔板中，加入培养基培养过夜。用含1 %胎牛血清的RPMI-1640培养基配制2.5 μmol/L和10 μmol/L的ARG溶液待用，用10 μl移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，PBS清洗掉脱落的细胞，加入ARG溶液培养24 h，2.5，10 μmol/L ARG组及阴性对照分别设3个复孔。吸去培养基，用PBS清洗3次后，倒置荧光显微镜下观察并拍照。以划痕修复率的大小表示药物抑制细胞迁移能力作用的强弱，修复率越小则抑制迁移能力作用越强，反之则越弱。划痕修复率=（初始划痕宽度-终末划痕宽度）/初始划痕宽度[7]。

2.5 RT-PCR法检测基质金属蛋白酶9（MMP-9）、MMP-2、CXC趋化因子受体4（CXCR4）的基因表达差异

将PC3细胞以2×105个/孔接种到6 孔板中培养过夜后，加入100 μmol/L、50 μmol/L ARG处理48 h，设无药物处理的阴性对照。以Trizol法提取细胞总RNA，测其浓度并以总RNA作为模板逆转录合成cDNA。将cDNA分别稀释2倍及5倍，作为模板进行RT-PCR扩增，扩增体系为20 μl：SYBR Green Master 10 μl，cDNA 5 μl，引物 5 μl。利用2-ΔΔCT法进行相对定量分析[8]。基因引物及其序列见表1。

表1 基因引物序列

2.6 Western blot法检测MMP-9、MMP-2、CXCR4的蛋白表达

细胞以5×105个/孔接种至6 孔板中培养过夜，贴壁后分别加入100 μmol/L、50 μmol/L的ARG溶液处理细胞48 h，设阴性对照组，用胰酶消化、收集细胞。每管细胞加50 μl细胞裂解液，轻轻吹打混匀，冰上裂解30 min。裂解完成细胞液14 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集上清，得到细胞全蛋白提取液。以Bradford 法测定蛋白质浓度，调整各样品至相同浓度，加入适量5×loading buffer，95 ℃金属浴煮10 min，上样。SDS-PAGE凝胶90 V下电泳0.5 h，140 V下电泳2 h，295 mA转膜2 h，再经封闭，一抗孵育，二抗孵育并胶片显色，凝胶成像仪检测MMP-9、MMP-2、CXCR4及内参GAPDH蛋白条带并拍照。

2.7 统计分析

用 Excel 软件处理数据，用 SPSS 13.0软件进行数据分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ARG对PC3细胞增殖的影响

以MTT法检测ARG对PC3细胞增殖的影响，结果见图1。ARG能抑制PC3细胞的增殖，并且具有明显的浓度和时间依赖性。ARG处理48 h组细胞存活率明显低于处理24 h组，其差异有统计学意义（P＜0.05）。ARG处理48 h组IC50值为20.1 μmol/L。

图1 ARG对PC3细胞增殖的影响

3.2 ARG对PC3细胞侵袭的影响

见图2。由图2可见，作用12 h后，ARG 10 μmol/L和2.5 μmol/L均能有效抑制PC3细胞侵袭，侵袭细胞数明显低于空白对照组，且具有浓度依赖性（P＜0.01，P＜0.05）。两组侵袭抑制率分别为73.5 %、51.3 %。

图2 PC3细胞侵袭情况

3.3 ARG对PC3细胞迁移的影响

ARG作用24 h后，细胞迁移能力明显降低，且具有浓度依赖性，结果见图3。由表2数据可知，ARG 2.5 μmol/L组和10 μmol/L组划痕修复率显著降低且明显低于空白对照组（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 ARG对PC3细胞迁移的抑制作用

表2 ARG对PC3细胞迁移的抑制作用

3.4 RT-PCR 结果分析

以β-actin为内参基因，空白对照组MMP-9、MMP-2、CXCR4基因表达作为100 %表达，由图4可见，ARG 50 μmol/L组和100 μmol/L组MMP-9、MMP-2、CXCR4基因表达较对照组均有明显降低，100 μmol/L组基因表达降低更显著。说明ARG可降低MMP-9、MMP-2、CXCR4的基因表达，且作用具有浓度依赖性。

图4 MMP-9、MMP-2、CXCR4的基因相对表达量

3.5 Western blot检测结果

结果见图5。其中，以GAPDH作为内参，各组中内参GAPDH的含量相当，提示各上样孔中总蛋白量相同。与空白对照组比较，ARG 50 μmol/L组和100 μmol/L组MMP-9表达水平显著降低；ARG 100 μmol/L组CXCR4表达水平明显降低，50 μmol/L组无明显变化；在两种浓度ARG作用下，MMP-2表达水平无明显变化。

图5 Western blot法检测MMP-9、MMP-2、CXCR4的表达

4 讨论

ARG对多种肿瘤细胞有抗瘤作用，主要有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞分化、细胞周期阻滞、介导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭及转移、逆转肿瘤药物耐药性等[9-11]。前列腺癌是常发于中老年男性的恶性肿瘤，早期多无明显症状而难以发现，后期则易发生侵袭和转移，使其呈浸润生长，是导致患者最终死亡的重要原因。CXCR4是具有跨膜结构的G蛋白耦联受体，在直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中的表达水平异常升高，并可促进肿瘤生长、转移、肿瘤血管生成，是肿瘤发生侵袭与转移的重要标志物[12]。肿瘤细胞的侵袭、转移过程可分为黏附、降解与转移3步，首先，肿瘤细胞脱离原发灶后，黏附于基底膜及胞外基质蛋白并激活有关基质蛋白溶解的蛋白水解酶，如MMP家族。酶家族成员中的MMP-9和MMP-2等可降解基底膜及胞外基质，为肿瘤细胞的侵袭、转移打开通道[10]。因此，可在ARG处理后，通过检测与细胞侵袭转移密切相关的MMP-9、MMP-2和CXCR4的基因与蛋白表达变化，并结合对细胞侵袭、转移能力的影响，确定ARG的抑制侵袭与转移活性。

本研究在体外利用Matrigel胶和聚碳酸酯膜制成与天然基质膜极为相似的人工膜，以过膜细胞数衡量侵袭能力，观察到ARG对PC3细胞的侵袭有显著抑制作用，并具有浓度依赖性。细胞划痕实验中，3组初始划痕宽度相近，作用24 h后差异显著，ARG 2.5 μmol/L组和10 μmol/L组划痕修复率显著降低且明显低于空白对照组。已有研究报道，ARG作用于肝癌SMMC-7721细胞时，可降低细胞黏附能力，阻止细胞侵袭迁移[10]，本研究结果同样证实ARG具有抑制PC-3细胞侵袭、迁移的能力。RT-PCR实验检测侵袭、迁移相关基因MMP-9、MMP-2和CXCR4的表达，结果显示，ARG 50 μmol/L组和100 μmol/L组3种基因表达量均低于对照组，厉晶萍等[13]发现，丹参酮联合大黄素可通过抑制 NF-κB 信号通路抑制HCC细胞中 MMP-9 的表达，从而抑制HCC细胞的侵袭、迁移，推测ARG通过下调MMP-9、MMP-2和CXCR4的基因表达来抑制PC3细胞的侵袭、迁移[14]。Western blot 结果显示，经ARG作用48 h后，MMP-9、CXCR4的蛋白表达水平明显降低，MMP-2蛋白水平无明显变化，推测其基因水平的变化还未反映到蛋白水平表达。

ARG作为一种细胞毒药物，具有多种生物学活性，可作用于多种肿瘤细胞，对前列腺癌PC3细胞具有显著作用。本研究结果表明：ARG在体外可抑制PC3细胞的侵袭、迁移，推测与其下调MMP-9、MMP-2和CXCR4的基因与蛋白表达有关。有关ARG抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的分子机制还有待于进一步研究。