顾芬芬，胡楚玲，台宗光，高 申，陈中建，3*

1上海交通大学医学院附属新华医院药学部，上海200092；2海军军医大学附属长海医院药学部，上海200092；3上海中医药大学附属皮肤病性病医院药学部，上海200050

世界每年新发前列腺癌患者达1800万人次[1]，早期诊断是其治疗的关键。超声检查是前列腺疾病诊断的主要手段[2]，清晰的、特异性的显影是提高前列腺癌早期诊断率的关键。然而，传统的造影剂在超声透射中不够稳定，分布较为扩散，造影回声较差[3，4]，且其非特异性显影常常导致前列腺癌的早期诊断率下降或错误诊断的发生[5-7]。

正常组织的血管内皮间隙紧密，大分子和脂质颗粒不易透过血管壁，而肿瘤组织血管丰富且血管内皮间隙较宽，因此特定粒径的脂质颗粒物质可以通过并滞留，这种肿瘤组织的高通透性和滞留效应简称高通透性和滞留效应（EPR效应）[8，9]。此中有无机纳米材料——多壁碳纳米管。由于其特定的粒径具有EPR效应，从而可实现肿瘤部位的被动靶向效应。通过共价结合肿瘤部位靶向的特定配体可实现肿瘤主动靶向作用[8]。前期实验将多壁碳纳米管进行了聚乙二醇（PEG）水化后，采用前列腺特异性膜抗原（PSMA）特异靶向结合的核苷酸适体A10-3.2修饰，制备出前列腺癌靶向的纳米超声造影剂，并对其进行了初步评价[10]。本课题中，对该纳米靶向造影剂的细胞摄取、体内靶向性及显影性作了进一步评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器

激光共聚焦显微镜（Thorlabs，America）；流式细胞仪（赛默飞FlowCAM®8100）；超声造影仪（90 scanner，Esaote Medical Systems，Genova，Italy）；活体成像仪（Bio-Real奥地利）。

1.2 材料

多壁碳纳米管（Brattleboro，VT，USA）；NH2-PEGCOOH（MW：2000，BO生物科技有限公司）；核苷酸适体及PEG修饰的多壁碳纳米管MWCNT-PEGAp（前期实验制备）；EDC、NHS（阿拉丁生物科技有限公司）；香豆素-6（赛默飞生物科技）；DAPI、DMEM、FBS、青霉素（Life Technologies）；链霉素（本市医药公司）；抗PSMA适体A10-3.2（5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-3′，锐博生物科技有限公司）；DIR（1，1‘-dioctadecyl-3，3，3’，3‘-tetramethylindotricarbocyanine iodide，北京泛博生物化学有限公司）。

1.3 细胞系及细胞培养

过表达PSMA抗原的前列腺癌PC3细胞购自于中科院上海分院。利用RPMI1640+10%FBS+1%青霉素+1%链霉素于37℃、5%CO2孵箱中培养。细胞每2天消化传代，一传二，所有细胞培养过程严格按照培养规程及无菌条件操作。

1.4 动物

雄性BALB/c裸鼠（4周大小）由第二军医大学动物实验中心购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，作SPF级别饲养。许可证号：SCXK（沪）2012-0002。所有动物实验均按照实验中心规章制度及第二军医大学伦理委员会规定实施。

2 方 法

2.1 细胞摄取流式考察

以香豆素6为荧光标记物。取1 mg香豆素6，MWCNT-PEG-Ap 50 mg，室温避光搅拌6 h，纯净水离心洗涤3次，得包裹香豆素6的纳米超声造影剂。

对数生长期的PC3细胞采用RPMI 1640+10%FBS+1%青霉素+1%链霉素于37℃、5%CO2孵箱中培养，铺12孔板。每孔2×105个，培养24 h，使其充分贴壁，更换新鲜含有不同浓度包载香豆素6的纳米超声造影剂或单体香豆素6的培养基溶液，孵育3 h，PBS洗涤3次，消化，离心收集细胞，悬浮于0.5 mL PBS中，流式细胞仪测定荧光强度，定量考察纳米超声造影剂细胞摄取情况。

2.2 细胞摄取共聚焦显微镜考察

对数生长期的PC3细胞铺24孔板，每孔中放置一枚盖玻片，每孔105个细胞，24h充分贴壁后，更换新鲜含有包载香豆素6的纳米超声造影剂或含有单纯香豆素6的培养液（香豆素6浓度为100 ng·mL-1），孵育4 h，PBS清洗3次，4%甲醛固定0.5 h，DAPI染色0.5 h后PBS洗涤3次，采用封片液封片，激光共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。

2.3 体内超声显影考察

采用裸鼠移植瘤模型为体内考察模型。对数生长期PC3细胞，以107个/mL的浓度皮下种植于4周大小雄性裸鼠右上臂，当肿瘤长至0.8~1 cm时，将裸鼠随机分为3组：（a）PBS、（b）MWCNT-PEG、（c）MWCNT-PEG-Ap。每组尾静脉注射相应溶液后，采用2%的戊巴比妥溶液麻醉，于给药1、8、24 h观察裸鼠肿瘤、心脏、肾脏部位的超声显影效果。

2.4 体内靶向性研究

采用裸鼠移植瘤模型作体内考察。对数生长期PC3细胞，以107个/mL的浓度皮下种植于4周大小雄性裸鼠右上臂，当肿瘤长至0.8~1cm时，将裸鼠随机分为3组：（a）PBS、（b）DIR、（c）MWCNT-PEG-Ap-DIR。每组尾静脉注射相应溶液8 h，取出裸鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，对其进行荧光信号采集。

2.5 统计方法

数据采用平均值±标准差（x±s）表示，组间统计差异比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 细胞摄取流式情况

有效的细胞摄取是纳米超声造影剂进入肿瘤部位的前提条件，因此采用PC3细胞为模型细胞，利用流式细胞仪定量考察其细胞的摄取情况，结果如图1所示。

图1 流式细胞摄取图

由图1表明，多壁碳纳米管在低浓度时细胞摄取呈现一定的浓度依赖性，而当浓度增加到200μg·mL-1时，细胞摄取量几乎达到100%，且相比于对照组单体而言，纳米超声造影剂能够有效地被细胞所摄取。

3.2 细胞摄取共聚焦情况

采用PC3细胞考察细胞摄取纳米造影剂的情况及其在细胞内分布状况，结果如图2所示。

图2 纳米造影剂细胞摄取激光共聚焦显微镜图

由图2可知，纳米造影剂相比于单体香豆素6能够有效地被细胞摄取，其结果与流式定性结果相一致。DAPI为细胞核染色试剂，香豆素6的绿色荧光与核染的蓝色荧光几乎无重叠，说明该纳米造影剂分布于细胞质中，提示其无核酸侵袭性。

3.3 体内超声造影情况

对造影剂的体内显影情况做进一步的考察，以PBS为对照组，考察给予造影剂1、8、24 h后，肿瘤部位及心脏、肾脏的显影情况，以评价该纳米造影剂肿瘤诊断效果及体内的分布、代谢情况，结果如 图3所示。

图3 体内显影效果图

由图3可知，PBS几乎无任何显影作用，肿瘤、肾脏、心脏部位在给药后均不可见。尾静脉注射纳米造影剂后1 h，隐约可见肿瘤；给予造影剂8 h后肿瘤部位显影明显，且MWCNT-PEG-Ap组较MWCNT-PEG组更为清晰、明亮，说明适体修饰后该纳米造影剂更具肿瘤靶向性；给予造影剂24h后，肿瘤部位显影变弱，说明纳米造影剂发生了代谢。

对代谢器官肾脏进行了考察，结果表明，该造影剂经过肾脏代谢，在造影剂给予8 h后肾脏显影尤为明晰；而24 h后，肾脏显影衰退，说明该造影剂已经大部分代谢排出体外，也提示该造影剂体内蓄积时间短，毒性较小。由心脏显影情况可知，该造影剂几乎无心脏分布，进一步提示该造影剂靶向性良好，毒性低。

3.4 体内靶向性

对造影剂体内靶向性进行深入考察，以DIR为荧光标记物，注射8 h后考察荧光在体内各脏器的分布情况，其结果如4所示。

由图4可知，游离的荧光剂单体在体内各脏器中均有分布，而纳米超声造影剂无心脏和脾脏分布，且绝大多数分布于肿瘤组织中，具有一定的肿瘤靶向性，此结果提示该造影剂靶向性良好，毒性较低。

图4 体内靶向性显影图

4 讨论

本课题在前期研究的基础上，对核酸适体修饰的纳米超声靶向造影剂作进一步考察与研究，结果表明，此新型造影剂具有良好的体外细胞摄取、体内靶向性和显影性。良好的细胞摄取是纳米材料产生生物学效应的基础[11，12]，此种新型纳米造影剂可有效地被细胞摄取，且摄取后无细胞核侵袭性。更重要的是，该造影剂在体内具有较强的靶向显影作用，且体内主要经由肾脏代谢，无心脏分布。因此本课题研究证明，此种新型纳米超声造影剂安全、有效、靶向性强，具有较强的临床转化潜力[13，14]。