郑抒，谢静，秦剑

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121）

香豆素是化学式以苯并-α-吡喃酮为母核的一类化合物的总称［1］，具有香甜气味，可作为沐浴露、香水、精油等化妆品的增香剂［2］，但大部分香豆素类化合物在化妆品中被禁用。合成香豆素类化合物对人体毒性大，会引发肝功能损伤［3］，且天然香豆素因其光敏作用［4-6］易导致涂抹在皮肤上会引起皮肤红斑、色素沉着过度等皮肤损伤，甚至皮肤癌［7］。不少国家都严格限制了该类化合物在化妆品中的添加和使用。德国联邦风险评估研究所明确要求，婴幼儿护理产品中不得添加香豆素类化合物［8］。欧洲联盟发布的26种化妆品香料过敏原名单中也有香豆素［9］。我国《化妆品安全技术规范（2015年版）》（以下简称《2015版规范》）明确规定，苯丙香豆素、六氢化香豆素等香豆素类化合物为化妆品中禁用物质［10］。针对香豆素类化合物的检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）法［11-12］、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法［13-15］、气相色谱法［16］、气相色谱-质谱（GC-MS）法［17］等。《2015版规范》仅收载了6-甲基香豆素、8-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡内酯、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄铜9种香豆素类化合物的HPLC法［9］。相较于HPLC法和CC-MS/MS法，GC-MS法具有不使用有机流动相、定性定量准确、不易残留、试验方法易复制等优点，特别适合易挥发化合物的检测。但该方法在化妆品中香豆素类化合物的检测中应用较少，涉及的检测方法有限，检测对象不够全面。刘思然等［17］建立了GC-MS法测定27种香料，其中涉及的香豆素类化合物包括6-甲基香豆素和香豆素。漆爱明等［18］优化了国标方法，并建立了同时测定化妆品中19种香料的GC-MS法，其中并未涉及香豆素类化合物。已报道的针对香豆素类化合物的定性或定量分析研究中，种类覆盖不完全，尤其是关于苯丙香豆素、六氢化香豆素的检测方法鲜有报道。本研究中选择《2015版规范》中明确规定禁用但无检测方法的4，6-二甲基-8-特丁基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、苯丙香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、六氢化香豆素，以及植物提取物中常见的7-羟基-6-甲氧基香豆素（别名为东莨菪内酯）和5，7-二甲氧基香豆素［1］为研究对象，建立了检测化妆品中上述8种香豆素类化合物的GC-MS法，为该类物质的检测及其在化妆品中的风险评估提供技术支持。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TSQ 8000 Evo型三重四极杆气质联用仪，电子轰击离子源（美国赛默飞公司）；MSA225S-1CE-DI型天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；XPE204型天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为万分之一）；Multi Reax型恒温混匀器（德国Heidolph公司）；KQ-800KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为800 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

苯丙香豆素标准品（phenprocoumon，纯度为96%，批号为4-RTW-119-6），六氢化香豆素标准品（hexahydrocoumarin，纯度为96%，批号为5-KHI-39-2），4，6-二甲基-8-特丁基香豆素标准品（4，6-dimethyl-8-tert-butylcoumarin，纯度为96%，批号为6-CWA-105-3），5，7-二甲氧基香豆素标准品（5，7-dimethoxycoumarin，纯度为98%，批号为2-HBS-28-1），均购于加拿大Toronto Research Chemicals公司；7-甲氧基香豆素标准品（7-methoxycoumarin，纯度为99%，批号为26723，美国AccuStandard公司）；7-乙氧基-4-甲基香豆素标准品（7-ethoxy-4-methylcoumarin，纯度为98%，批号为10214970，美国Alfa Aesar公司）；7-甲基香豆素标准品（7-methylcoumarin，纯度为99.8%，批号为A0013703，中国Bepure公司）；7-羟基-6-甲氧基香豆素标准品（scopoletin，纯度为99.9%，批号为00019090-622，美国ChromaDex公司）；甲醇（质谱纯，批号为CG2113850，美国Fisher公司）；二氯甲烷（色谱纯，批号为29Y1902FK，美国ACS公司）；纯化水（18.2 MΩ·cm，默克密理博纯水机）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 GC条件

色谱柱：Thermo TG-5SILMS弱极性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：氦气；流速：1.0 mL/min；分流比：1∶10；分流流量：10 mL/min；进样量：1 μL；进样口温度：250℃；程序升温：80℃、保持3 min，以8℃/min的速率升至240℃、保持5 min；运行时间：28 min。

2.1.2 MS条件

离子化方式：电子轰击（EI）离子源；电子轰击源：70 eV；扫描方式：选择离子监测（SIM）；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃。各化合物的采集参数见表1。

表1 8种香豆素化合物的保留时间与特征离子Tab.1 Retention time and characteristic ions of the eight coumarins

2.2 样品前处理

水剂类化妆品（含香水）：取样品0.2 g，精密称定，置具塞比色管中，用二氯甲烷定容至10 mL，充分振荡均匀，超声，取上清液，经0.22 μm有机相滤膜滤过，进样分析。

乳液、膏霜类化妆品：取样品0.2 g，精密称定，置具塞比色管中，加入1.0 mL饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷定容至10 mL，充分振荡均匀，超声，取上清液，经0.22 μm有机相滤膜滤过，进样分析。

2.3 标准品溶液配制

取六氢化香豆素和7-羟基-6-甲氧基香豆素标准品各适量，精密称定，溶于甲醇，配制成质量浓度分别为200 mg/L和40 mg/L的标准品溶液；其余6种香豆素标准品同法配制为质量浓度为100 mg/L。取上述标准溶液适量，用二氯甲烷稀释，六氢化香豆素质量浓度为2.00，5.00，10.00，20.0，40.0，100.0 mg/L，7-羟基-6-甲氧基香豆素质量浓度为0.40，1.00，2.00，4.00，8.00，20.0 mg/L，其余6种香豆素质量浓度为1.00，2.50，5.00，10.0，20.00，50.0 mg/L的系列混合标准品溶液。

2.4 方法学考察

线性关系考察与检测限、定量限确定：取2.3项下混合标准品溶液，按2.1项下色谱与质谱条件进样分析。以8种香豆素类化合物的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、相应峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，详见表2。取样品0.2 g，精密称定，加二氯甲烷稀释至10 mL，以3倍信噪比计算检测限，以10倍信噪比计算定量限。结果见表2。

表2 8种香豆素化合物的线性关系考察结果与检测限、定量限Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ of the eight coumarins

加样回收试验与精密度试验：在水剂、乳液和膏霜3种化妆品空白基质中，添加2.3项下混合标准品溶液，六氢化香豆素质量浓度分别为5.0，10.0，40.0 mg/L，7-羟基-6-甲氧基香豆素分别为1.0，2.0，8.0 mg/L，其余6种香豆素化合物分别为2.5，5.0，20.0 mg/L。同样品前处理方法进一步处理，按2.1项下色谱与质谱条件进样分析，各水平检测6份平行样品。结果见表3。3种化妆品空白基质在其余6种香豆素加标质量浓度为2.5 mg/L、六氢化香豆素为5.0 mg/L、7-羟基-6-甲氧基香豆素为1.0 mg/L的SIM图见图2。结果表明，8种香豆素类化合物在3种不同基质中含量的RSD在0.91%～5.68%范围内，均小于6%，表明方法的精密度良好。回收率在89.78%～116.64%范围内，造成部分化合物回收率偏高的原因可能是由化妆品的基质效应导致，与化妆品基质复杂，各种物质的干扰较多，导致回收样品基线偏高，且回收率整体偏高趋势一致。

表3 3种空白基质加样回收试验和精密度试验结果（%，n=6）Tab.3 Results of the recovery test and the precision test of the three types of blank matrixes（%，n=6）

2.5 实际样品检测

香豆素类物质若添加进化妆品，会作为增香剂使用，且具有一定光敏特性，故选择香豆素类化合物使用可能性较大的香水类、沐浴洗发类非特殊护肤品样品各10份，防晒剂特殊类护肤品样品10份，依据本研究中建立的方法进行检测。结果显示，该30份样品中均未检出8种香豆素类化合物。

3 讨论

3.1 色谱柱选择

考虑到8种香豆素类化合物都具有一定极性，强极性色谱柱稳定性不强，升温到一定程度时基线易漂移，影响检测结果，故未选择强极性色谱柱。本研究中比较了实验室常见的中极性（DB-624，30 m×0.25 mm，1.4 μm）和弱极性（TG-5SILMS，30 m×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱中各组分的分离情况。中极性色谱柱未检出苯丙香豆素，且7-乙氧基-4-甲基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素3种化合物的出峰时间较晚，其中，7-羟基-6-甲氧基香豆素因出峰时间过长导致拖尾严重，影响检测限。弱极性色谱柱能同时检出这8种香豆素类物质，分离度理想，峰形尖锐对称。综合考虑化合物的总运行时间、分离度与峰形，最终选择弱极性色谱柱进行检测。

1.六氢化香豆素2.7-甲基香豆素3.7-甲氧基香豆素4.4，6-二甲基-8-特丁基香豆素5.7-羟基-6-甲氧基香豆素6.7-乙氧基-4-甲基香豆素7.5，7-二甲氧基香豆素8.苯丙香豆素A.水剂B.乳液C.膏霜图2 3种空白基质在同一加标质量浓度的选择离子监测图1.Hexahydrocoumarin 2.7-Methylcoumarin 3.7-Methoxycoumarin 4.4，6-Dimethyl-8-tert-butylcoumarin 5.Scopoletin 6.7-Ethoxy-4-methylcoumarin 7.5，7-Dimethoxycoumarin 8.PhenprocoumonA.Liquid preparation B.Emulsion preparation C.Cream preparationFig.2 SIM diagrams of the three types of blank matrixes adding mixed standard solution with the same mass concentration

3.2 萃取溶剂选择

8种香豆素类化合物在甲醇中的溶解度均很好。但考虑到甲醇极性较大，使用甲醇作为萃取溶剂会对弱极性色谱柱造成很强的柱流失。同时，正己烷与甲醇不互溶，四氢呋喃对仪器有一定腐蚀性，丙酮为易制毒类试剂，故采用二氯甲烷作为萃取溶剂。标准曲线的配制由二氯甲烷稀释标准混合品溶液后得到。香豆素类化合物在各种剂型的化妆品中分布广泛，香水等液体类化妆品可直接用二氯甲烷分散并超声溶解；对于不易分散的乳霜等其他类化妆品，采用1.0 mL氯化钠饱和溶液破乳后，再加入二氯甲烷振荡，分散样品，超声提取。

3.3 方法评价

本研究中建立了同时测定化妆品中8种香豆素类化合物的GC-MS法，对水剂类、乳液类、膏霜类3种不同基质的化妆品进行了相应前处理，且8种香豆素类物质得到满意分离，获得了各化合物的特征离子数据，方法定性定量准确、操作简便，精密度和回收率试验结果能满足检测要求，可为香豆素类化合物在化妆品中的风险监督提供技术支持。