林志强 唐学义 刘洪洲 仝兰芝

(1濮阳市人民医院呼吸内科，河南 濮阳 457000；2河南省人民医院呼吸内科；3濮阳市中医院神经内科)

肺癌的发生是包含抑癌基因失活和癌基因激活在内的多基因、多阶段的复杂过程，寻找与肺癌发生发展相关的基因，并研究其分子机制，对于肺癌的靶向治疗具有重要意义。肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)4定位于17q11-12，多种人类癌症中已发现TRAF4过表达，如乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等〔1～3〕。有研究发现，抑制TRAF4表达可降低肺癌细胞增殖〔4〕，但关于TRAF4对肺癌生物学特性的影响尚不完全清楚。替莫唑胺是一种新一代的口服烷化剂，不仅作为复发脑胶质瘤治疗药物，在肺癌的治疗中也得到广泛应用。研究发现，单独使用替莫唑胺可延长肺癌患者的生存期，增加化疗敏感性〔5〕；也有研究发现替莫唑胺可抑制肺癌细胞活力，阻滞细胞周期〔6〕。目前关于TRAF4是否可增加肺癌替莫唑胺化疗敏感性尚不清楚。因此，本研究通过RNA干扰(RNAi)技术沉默肺癌细胞TRAF4表达，探讨抑制TRAF4表达后替莫唑胺单独及共同处理对肺癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂和仪器 人胚肺成纤维细胞MRC5及肺癌SPC-A-1、A549、H322、H1299细胞均购自中国科学院上海细胞库；替莫唑胺购自中国食品药品检定研究所(批号：100639-201302，纯度为99.6%)；胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；荧光定量试剂盒及反转录试剂盒购自日本Takara；CCK8细胞增殖试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)细胞凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Notch1、Hes1抗体购自美国Abcam公司；酶标仪购自美国Bio Tek公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2TRAF4在肺癌细胞中的表达 MRC5、SPC-A-1、A549、H322、H1299细胞在37℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度条件下用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基培养。通过RT-PCR方法检测各细胞中TRAF4 mRNA表达，步骤如下：通过Trizol法提取各细胞中的总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板的反应体系为20 μl，应用实时荧光定量PCR仪进行扩增。引物均由上海生工合成，TRAF4的引物序列，前向：5'-CTGGACATTTGATCATGCAG-3'，反向：5'-ATTTGATCCAATAGTTGCTCGA-3'。内参GA-PDH 的引物，反向：5'-GTCACCAGGGCTGCTTTTAA-CTC-3'，反向：5'- CAGCATCGCCCCACTTGATTTTG-3'。采用2-△△Ct比较法，根据Ct均值对TRAF4 mRNA相对含量进行定量分析。

1.3A549细胞分组及TRAF4的siRNA转染细胞 A549细胞分为空白对照组、阴性对照组、TRAF4-siRNA组、替莫唑胺(200 μmol/L替莫唑胺处理细胞)和TRAF4-siRNA+替莫唑胺组，TRAF4的siRNA转染A549细胞参照脂质体LipofectamineTM2000转染说明，转染前1 d以2×105/ml接种细胞于6孔板，每孔2 ml，细胞生长达到80%～90%汇合度时转染。培养48 h，收集细胞，用于后续实验。

1.4TRAF4的siRNA转染A549细胞效果检测 通过RT-PCR及Western印迹检测TRAF4的siRNA转染A549细胞效果。RT-PCR方法参照1.2。Western印迹检测步骤：细胞中加入适量的细胞裂解液提取细胞中总蛋白，BCA法定量蛋白，每泳道加入50 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，半干法转硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育一抗过夜，TRAF4及内参GAPDH抗体分别按照1∶500和1∶1 000稀释，洗膜，加入二抗，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，洗膜，化学发光法在紫外凝胶成像仪上进行拍照分析。

1.5CCK8法检测各组细胞活力 将100 μl生长至对数期的A549细胞接种至96孔细胞培养板中，每组细胞设置5个重复孔，并设置空白对照孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后按照1.3分组处理细胞，继续培养细胞48 h，每孔加入10 μl的CCK8溶液，37℃孵育4 h。空白对照孔调零，酶标仪测定570 nm波长各组的吸光度值(OD)。实验重复3次。以OD值反映细胞活力，可间接反映细胞的增殖能力。

1.6Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 磷酸缓冲液洗涤各组细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心后收集细胞，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒进行染色，1 h内上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.7Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达检测 凋亡蛋白Caspase-3、Bax及Notch1和Hes1蛋白表达参照1.4方法检测。

1.8统计学方法 采用SPSS21.0软件，计量资料多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1肺癌细胞TRAF4的表达 人胚肺成纤维细胞MRC5及肺癌SPC-A-1、A549、H322、H1299细胞中TRAF4 mRNA表达分别为1、(4.557±0.423)、(5.001±0.462)、(3.889±0.387)、(4.002±0.402)，TRAF4在4个肺癌细胞中的表达均显著高于在MRC5细胞中的表达(P<0.05)。

2.2TRAF4的siRNA转染肺癌A549细胞的效果 阴性对照组TRAF4的mRNA及蛋白表达与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，而TRAF4-siRNA组TRAF4的mRNA及蛋白表达均显著低于空白对照组(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western印迹检测TRAF4 siRNA 转染后肺癌A549细胞TRAF4蛋白表达

组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白空白对照组10.765±0.076阴性对照组0.982±0.0730.718±0.071TRAF4-siRNA组0.421±0.0521)0.121±0.0151)F/P值121.428/0.000105.056/0.000

与空白对照组比较：1)P<0.05

2.3TRAF4的siRNA转染增强替莫唑胺对肺癌A549细胞活力的抑制作用 TRAF4-siRNA组(0.394±0.045)和替莫唑胺组(0.351±0.040)OD值均显著低于空白对照组(0.587±0.067，均P<0.05)，高于TRAF4-siRNA+替莫唑胺组(0.226±0.032，均P<0.05)。

2.4TRAF4的siRNA转染增强替莫唑胺对肺癌A549细胞凋亡的促进作用 与空白对照组〔(2.67±0.45)%〕比较，TRAF4-siRNA组〔(7.86±0.75)%〕和替莫唑胺组细胞凋亡率〔(11.23±0.94)%〕均显著升高(均P<0.05)，而TRAF4-siRNA+替莫唑胺组细胞凋亡率〔(15.02±1.12)%〕显著高于TRAF4-siRNA组和替莫唑胺组(均P<0.05)。

2.5各组细胞中Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达检测结果 TRAF4-siRNA组和替莫唑胺组Caspase-3和Bax的表达均显著高于空白对照组(均P<0.05)，Notch1和Hes1表达显著低于空白对照组(均P<0.05)，TRAF4-siRNA+替莫唑胺组Caspase-3和Bax的表达显著高于TRAF4-siRNA组和替莫唑胺组(P<0.05)，Notch1和Hes1表达显著低于TRAF4-siRNA组和替莫唑胺组(P<0.05)。见图2，表2。

1：空白对照组；2：TRAF4-siRNA组；3：替莫唑胺组；4：TRAF4-siRNA+替莫唑胺组图2 各组细胞中Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1的蛋白表达

组别Caspase-3BaxNotch1Hes1空白对照组0.103±0.0110.116±0.0140.582±0.0680.315±0.039TRAF4-siRNA组0.171±0.0181)2)0.215±0.0251)2)0.322±0.0371)2)0.214±0.0271)2)替莫唑胺组0.206±0.0231)2)0.362±0.0421)2)0.203±0.0281)2)0.195±0.0211)2)TRAF4-siRNA+替莫唑胺组0.421±0.0450.568±0.0650.110±0.0130.106±0.012F/P值75.461/0.00068.029/0.00072.240/0.00031.121/0.000

与空白对照组比较:1)P<0.05；与TRAF4-siRNA+替莫唑胺组比较:2)P<0.05

3 讨 论

研究发现，包括肺癌在内的肿瘤中出现抑癌基因表达降低或缺失、癌基因表达升高等变化；且随着肿瘤恶性程度变化，基因的表达量升高或降低〔7〕。这提示在肺癌治疗中可采用分子靶向治疗途径。TRAF是重要的一类胞质衔接蛋白，主要参与肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的信号传导。TRAF4是TNFR家族中参与肿瘤调控的因子之一，在多种肿瘤中出现过表达。有研究发现，TRAF4可通过调控Wnt信号，增强口腔鳞状细胞癌的生长、迁移和侵袭能力〔8〕；食管癌中通过RNA干扰靶向抑制TRAF4表达可降低癌细胞的增殖、诱导凋亡，并阻滞细胞周期〔9〕。TRAF4对肺癌影响的研究不多，有研究发现，miR-615-5p可通过靶定TRAF4，下调TRAF4表达而抑制非小细胞肺癌细胞增殖〔10〕；在异种移植小鼠模型中，敲除TRAF4表达可降低肺癌的恶性表型〔11〕。这提示TRAF4可能是肺癌发生发展中的一个促进因子。

替莫唑胺为一种化疗药物，可影响肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤的发生发展〔12,13〕。RNA干扰是近些年发展起来的能够特异性和高效性地使体内特定基因表达阻断的技术，目前已广泛应用〔14,15〕。本研究发现TRAF4的表达抑制及替莫唑胺均可降低肺癌细胞活力，诱导细胞凋亡，两者联合使用效果更强。Caspase-3是Caspase家族的凋亡效应子，位于Caspase级联反应的下游，可被上游的始动子激活，Caspase-3的激活可引起细胞发生凋亡〔16〕。有研究发现，肺癌中Caspase-3表达降低，上调其表达可诱导细胞凋亡〔17〕。Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因，大多数肺肿瘤细胞株中Bax表达高于正常细胞，肺癌细胞中Bax的高表达可激活Caspase，抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡〔18,19〕。Notch1信号通路进化保守，在细胞的增殖、分化、凋亡、发育等过程中发挥重要作用，其异常表达与多种肿瘤发生有关〔20〕。Notch1的表达与肺癌的发生发展、转移和浸润有关，抑制其表达可降低肺癌的发生发展〔21〕。本研究发现，TRAF4的表达抑制及替莫唑胺均可上调Caspase-3和Bax表达，下调Notch1及下游重要靶基因Hes1表达，而两者联合使用效果更优。

综上所述，抑制肺癌细胞TRAF4表达可通过下调Notch1信号通路降低癌细胞活力及诱导细胞凋亡，并可增强替莫唑胺化疗敏感性；其中细胞凋亡的调控方式是上调Caspase-3和Bax表达。TRAF4可能是肺癌分子治疗的有效靶点，但鉴于TRAF4在肺癌中的研究较少，且本研究也只对细胞的增殖及凋亡情况进行检测，因此还需更多的实验研究及临床研究证实。