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白花丹素调节MEK/ERK通路增加脑胶质瘤U87细胞对替莫唑胺的敏感性研究

2021-11-16韩福新马善波

陕西医学杂志 2021年11期
关键词:白花货号培养液

韩福新,马善波,张 蕊

(1.西安市人民医院 西安市第四医院,陕西 西安710004;2.空军军医大学西京医院,陕西 西安710032)

脑胶质瘤是目前临床中常见的肿瘤之一,由于其具有发病率高及治愈率低等多种特点[1-2],所以治疗药物的研发仍是目前的临床工作重点。替莫唑胺是目前临床中应用广泛疗效确切的治疗脑胶质瘤药物,但在临床应用中表现出有效率低及复发率高等缺点[3],所以替莫唑胺与其他药物联合应用可能是提高其对脑胶质瘤治疗效果的有效手段。白花丹素是从紫雪花、白花丹等植物中提取得到的单体化合物,近年来研究[4-5]发现其对于胶质瘤细胞具有显著的增殖抑制及诱导凋亡作用。然而白花丹素联合替莫唑胺对于脑胶质瘤的作用及机制目前尚不清楚。研究[6-7]发现,MEK/ERK通路与脑胶质瘤的发生及发展密切相关,MEK/ERK通路的异常激活会导致脑胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力增加。本实验通过研究白花丹素联合替莫唑胺对人源脑胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用及对MEK/ERK通路的调节作用,为白花丹素在脑胶质瘤治疗中的药理作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人源脑胶质瘤U87细胞购自中国科学院上海细胞库。白花丹素(货号IP0650,纯度>98%);替莫唑胺(货号IT1330,纯度>98%);RPMI-1640培养液(货号10491);青霉素-链霉素混合液(货号P1400);胎牛血清(货号S9020);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号C1086);MEK(货号AF1057)、ERK(货号AF1051)、GAPDH(货号AF1186)兔单克隆抗体;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号A0208);RNA提取试剂盒(货号G3013);逆转录试剂盒(货号G3330);二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(货号P0012);CCK-8试剂盒(货号C0039);RIPA裂解液(货号P0013B);超敏ECL化学发光试剂盒(货号P0018M);磷酸盐缓冲液(PBS)(货号C0221A);TBST(货号ST671);PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。IX83荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯);Gel Doc EZ凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司);Spectra Max iD5酶标仪(美谷分子仪器有限公司);T100梯度PCR仪(美国BIO-RAD公司);BB150-2TCS CO2细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司);Allegra 64R台式高速冷冻离心机(贝克曼库尔特商贸有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:U87细胞复苏后使用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 mg/ml)的RPMI-1640培养液在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养,待U87细胞在培养皿中培养至约80%融合后进行后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测各组U87细胞增殖抑制率:在96孔细胞培养板上分别设置空白对照组、替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组,每组设置3个复孔。收集U87细胞,使用PBS洗涤3次,使用不含胎牛血清及青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液,调整细胞密度,按照4×103个细胞/孔的密度,将U87细胞接种到96孔板中培养24 h待细胞贴壁后去除培养液,替莫唑胺组加入含有浓度为100 μmol/L[8]替莫唑胺的新鲜培养液,白花丹素组加入含有浓度为10 μmol/L[9]白花丹素的新鲜培养液,白花丹素联合替莫唑胺组加入含有白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L)的新鲜培养液,空白对照组只更换新鲜培养液,分别继续培养24、48、72 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,继续孵育2 h后,将96孔板置于酶标仪上,在450 nm处测定各组细胞OD值,分别计算24、48、72 h各组U87细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-OD实验组/ OD空白对照组)×100%。每个实验独立重复3次。

1.2.3 划痕实验检测各组U87细胞迁移率:6孔板上分别设置空白对照组、替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组。调整U87细胞密度,按照为1×105个/孔将U87细胞接种于6孔板中,加入不含胎牛血清及青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养至细胞贴壁后,白花丹素组加入终浓度为10 μmol/L的白花丹素,替莫唑胺组加入终浓度为100 μmol/L的替莫唑胺,白花丹素联合替莫唑胺组加入白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L),空白对照组更换新鲜培养液,继续培养48 h后,使用200 μl移液枪尖头对细胞进行划痕,在显微镜下测量两条划痕间距离,记为0 h迁移距离,使用PBS洗涤两次,去除漂浮细胞后,加入不含胎牛血清及青霉素-链霉素的新鲜RPMI-1640培养液,于培养箱中继续培养24 h,显微镜下测量24 h划痕距离,记为24 h迁移距离,计算各组U87细胞迁移率。每个实验独立重复3次。细胞迁移率=(0 h迁移距离-24 h迁移距离)/ 0 h迁移距离×100%。

1.2.4 Transwell检测各组U87细胞侵袭能力:收集U87细胞,设置空白对照组、替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组,取约1×104个细胞接种于24孔Transwell小室的上室,白花丹素组加入终浓度为10 μmol/L的白花丹素,替莫唑胺组加入终浓度为100 μmol/L的替莫唑胺,白花丹素联合替莫唑胺组加入白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L),在24孔Transwell小室的下室补充含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液刺激细胞侵袭,于37 ℃培养箱中培养48 h后,用棉签去除上室的非侵袭细胞,下室的侵袭细胞用0.1%结晶紫染色,每组细胞随机选择4个视野,在显微镜下进行拍照并对各组迁移细胞数进行计数。每个实验重复3次。

1.2.5 TUNEL法检测各组U87细胞凋亡率:收集U87细胞,调整U87细胞密度为1×105个/孔将其接种于6孔板中,设置空白对照组、替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组,白花丹素组加入终浓度为10 μmol/L的白花丹素,替莫唑胺组加入终浓度为100 μmol/L的替莫唑胺,白花丹素联合替莫唑胺组加入白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L)培养48 h后,去除培养液,使用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温避光固定30 min,用PBS轻轻洗涤2次后,加入封闭液,室温孵育30 min,用PBS洗涤2次,滴加透化液,冰上4 ℃孵育2 min,PBS洗2次,每孔加入50 μl TUNEL反应混合物,在室温条件下避光孵育1 h,PBS洗涤后加入抗荧光淬灭封片液封片,置于荧光显微镜下观察并计数,计算各组U87细胞凋亡率。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数。每个实验重复3次。

1.2.6 RTq-PCR检测U87细胞MEK及ERK mRNA表达水平:U87细胞分别用浓度为10 μmol/L的白花丹素, 100 μmol/L的替莫唑胺,白花丹素(10 μmol/L)联合替莫唑胺(100 μmol/L)培养48 h后,使用TRIzol试剂从U87细胞中提取总RNA,使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA后,使用RTq-PCR试剂盒测定各组U87细胞MEK、ERK、GAPDH mRNA水平,结果以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.2.7 Western blot检测U87细胞MEK及ERK蛋白表达水平:U87细胞分别用浓度为10 μmol/L的白花丹素, 100 μmol/L的替莫唑胺,白花丹素(10 μmol/L)联合替莫唑胺(100 μmol/L)培养48 h后,去除培养液,使用PBS洗涤2次,使用RIPA蛋白裂解液提取总蛋白,4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min,取上清液,使用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白含量,取相当于40 μg蛋白的蛋白提取液,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样本,并转移至聚偏氟乙烯膜上,使用含有5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h后,使用MEK、ERK及GAPDH兔单克隆抗体(1∶500稀释)在4 ℃条件下孵育过夜,使用含吐温的PBS洗涤3次,5 min/次,使用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶1000稀释)室温孵育2 h,再次用含吐温PBS洗涤3次,使用化学发光试剂盒在凝胶成像仪中成像,使用ImageJ 1.8.0软件对蛋白条带进行定量分析。

2 结 果

2.1 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞的增殖抑制作用 见表2。与替莫唑胺组比较,白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞24、48、72 h增殖抑制率均显著升高(均P<0.05);与白花丹素组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞24、48、72 h增殖抑制率均增殖抑制率显著升高(均P<0.05)。

表2 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞的增殖抑制率比较(%)

2.2 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞迁移的影响 见图1。与空白对照组比较,替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞迁移率均显著降低(均P<0.05);与替莫唑胺组比较,白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞迁移率均显著降低(均P<0.05);与白花丹素组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞迁移率显著降低(P<0.05)。

2.3 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞侵袭能力的影响 见图2。与空白对照组比较,替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞侵袭细胞数均显著减少(均P<0.05);与替莫唑胺组比较,白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞侵袭细胞数均显著减少(均P<0.05);与白花丹素组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞侵袭细胞数显著减少(P<0.05)。

2.4 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞凋亡的影响 见图3。与空白对照组比较,替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05);与替莫唑胺组比较,白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05);与白花丹素组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与替莫唑胺组

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与替莫唑胺组

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与替莫唑胺组

2.5 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞MEK及ERK mRNA表达水平的影响 见表3。与空白对照组比较,替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK及ERK mRNA表达水平均显著降低(均P<0.05);与替莫唑胺组比较,白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK及ERK mRNA表达水平均显著降低(均P<0.05);与白花丹素组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK及ERK mRNA表达水平显著降低(均P<0.05)。

表3 各组U87细胞MEK及ERK mRNA表达水平比较

2.6 白花丹素联合替莫唑胺对U87细胞MEK及ERK蛋白表达水平的影响 见图4。与空白对照组比较,替莫唑胺组、白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK及ERK蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05);与替莫唑胺组比较,白花丹素组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK及ERK蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05);与白花丹素组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK及ERK蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与替莫唑胺组

3 讨 论

脑胶质瘤是临床常见的原发性颅脑肿瘤,是由于大脑和脊髓胶质细胞由于病毒感染、化学及电离辐射等多种原因引起的癌变,具有发病率及病死率高、治愈率低等特点。近年来流行病学研究[10]表明,脑胶质瘤患者的中位生存期为14.6个月左右,其发病率为5/10万以上,在全部中枢神经系统肿瘤患者中,脑胶质瘤患者约占27%,在恶性肿瘤中,其所占比例高达80%[11]。然而,临床中对于脑胶质瘤的治疗手段有限,主要采用手术治疗及放化疗的手段,但治疗效果并不理想。同时,目前临床中用于脑胶质瘤的化疗药物有限,替莫唑胺是目前已在临床中应用的疗效确切的治疗脑胶质瘤的药物,但在临床应用中也表现出有效率低、不良反应大等多种缺点,所以,对于治疗脑胶质瘤药物的研发仍是当前的工作重点之一。

白花丹素是从白花丹科植物,白花丹的根中提取得到的单体化合物。研究[12-14]表明,白花丹素对于卵巢癌、肝脏脂肪代谢异常、肾损伤等多种疾病具有显著的治疗作用。近年来有学者研究发现,白花丹素对于脑胶质瘤具有一定的治疗作用,其中,柴昌等[15]报道了白花丹素能够显著降低脑胶质瘤SWO-38和U251细胞的增殖和迁移,并能够促进SWO-38和U251细胞的凋亡;Niu等[16]研究发现白花丹素能够显著抑制脑胶质瘤U87和U251细胞的增殖和迁移;此外,Chen等[17]发现白花丹素能够通过调节FOXM1及其下游蛋白,进而抑制U87、A172、SHG44、U251细胞的增殖并促进其凋亡,由此可见白花丹素对于脑胶质瘤的治疗具有较大的潜力,然而其具体作用机制,及其对于替莫唑胺是否具有增敏作用目前尚不清楚。

本文通过研究白花丹素联合替莫唑胺对脑胶质瘤U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响,结果发现,白花丹素组、替莫唑胺组及白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞迁移率、侵袭细胞数均显著降低,而U87细胞凋亡率则显著升高,且与白花丹素及替莫唑胺单独给药组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞迁移率、侵袭细胞数降低更明显,而U87细胞凋亡率则升高更显著,提示白花丹素能够显著增加U87细胞对替莫唑胺的敏感性,且白花丹素联合替莫唑胺能够显著抑制U87细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导U87细胞凋亡。

MEK/ERK通路主要参与细胞的增殖及凋亡等生理过程,近年来研究表明其在脑胶质瘤细胞的侵袭、迁移等活动中起关键作用。孙关等[18]研究miR-15b对人胶质瘤细胞株A172细胞的影响,发现MEK/ERK通路在A172细胞的增殖和凋亡过程中起关键作用,miR-15b则能够通过抑制MEK/ERK通路相关蛋白,导致A172细胞G0/G1期阻滞,进而导致A172细胞凋亡。王帆等[19]研究发现迁移诱导基因7能够抑制脑胶质瘤U251细胞的MEK及ERK蛋白水平,进而抑制U251细胞的侵袭能力。赵永顺等[20]报道MEK/ERK信号通路的激活与脑胶质瘤U87细胞的增殖、侵袭和凋亡有关,而抑制MEK/ERK信号通路的激活及相关蛋白水平,则能够显著诱导U87细胞凋亡。由此可见MEK/ERK通路在脑胶质瘤的发生发展中起关键作用,而抑制MEK/ERK通路的过度激活则可能是治疗脑胶质瘤的潜在靶点和途径。本研究结果表明,白花丹素联合替莫唑胺能够显著抑制U87细胞MEK、ERK蛋白水平的升高,且与替莫唑胺单独给药组比较,白花丹素联合替莫唑胺组U87细胞MEK、ERK蛋白水平降低更明显,提示白花丹素可能是通过抑制U87细胞MEK/ERK通路的过度激活,抑制相关蛋白的表达,进而增加U87细胞对于替莫唑胺的敏感性。

综上所述,白花丹素能够增强U87细胞对替莫唑胺的敏感性,显著抑制U87细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导U87细胞凋亡,其机制可能与调节MEK/ERK通路有关。

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