余晨，熊希倩，詹江华，胡晓丽，高伟

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是严重威胁婴幼儿生命的胆道梗阻性疾病。目前认为该病主要由炎症引起，可导致继发性的肝内外胆道梗阻、纤维化，继而形成肝衰，但其确切的病理生理学机制尚未完全明确［1］。胆道闭锁Kasai手术旨在解除胆道梗阻、重建肝外胆道、开放胆汁引流，但术后难以避免的进展性肝纤维化及肝硬化是制约自体肝生存时间的关键因素，仍困扰着大多数研究者［2］。

肝脏纤维化的主要特征为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成大于降解，致使其沉积过多［3］。通过对组织沉积物的研究发现，基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）家族在ECM的降解过程中占据主要地位，是影响肝纤维化的重要因素［4］。此前已有学者关注MMPs与BA肝纤维化之间的联系，但大多数对于MMPs的研究主要集中于MMP-2、MMP-3、MMP-9等物质，且多数都强调其在血清中的表达，而对于MMP-7的了解却知之甚少［5-7］。最新的一项研究证实，MMP-7的表达对于诊断BA及预测Kasai术后肝纤维化程度具有高度的特异性［8］。基于上述原因，本文拟从肝脏移植时获取的BA患儿病肝组织出发，并对比Kasai术时的肝活检组织，应用免疫组化手段检测MMP-7蛋白在Kasai术时及Kasai术后不同时间段患儿肝组织中的表达情况，同时研究其与肝纤维化程度、胆管反应之间的关系，探索BA患儿肝脏进行性纤维化的原因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取天津市儿童医院2017年6月—2018年4月收集到胆道闭锁患儿行Kasai手术时的肝活检组织共计15例（Kasai组，即G1组），其中男7例，女8例；同时收集2015年1月—2016年1月在天津市第一中心医院因Kasai术后肝功能衰竭而行肝移植病肝组织共计41例（移植组），其中男17例，女24例，患儿均为出生后3个月内行Kasai手术，平均手术日龄为（59.18±14.52）d，后因肝脏功能衰竭而行肝移植手术。肝移植标准［9］：（1）终末期肝病诊断明确，伴有肝硬化的并发症（腹水、脑病、消化道出血等）。（2）生长发育障碍。（3）反复胆管炎发作，严重影响患儿生活质量。将移植组按患儿行Kasai手术与肝移植手术的间隔时间分为2组：G2组28例，间隔时间＜2年；G3组13例，间隔时间≥2年。本研究经过医院伦理委员会审查通过。

1.2 研究方法

1.2.1 组织处理 肝组织标本均取自术中肝右叶前缘组织，10%福尔马林固定、石蜡包埋后，将蜡块标本连续4µm切片，用于HE染色及免疫组化染色（CK-19、MMP-7抗体及染色工作液均购自北京中杉金桥生物科技有限公司）。

1.2.2 HE染色 病理切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水洗后，苏木素浸5 min，酸化伊红乙醇液浸染2 min，再经梯度乙醇脱水，透明剂浸泡至透明，中性树胶封片等操作，在光学显微镜下观察肝组织纤维化程度。

1.2.3 免疫组化染色 病理切片经脱蜡至水，放置于枸橼酸盐缓冲液中进行抗原修复15 min，冷却至室温，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗5 min×3次，于3%H2O2中37℃孵育10 min，再用PBS冲洗5 min×3次，分别滴加一抗（MMP-7、CK-19），放置于4℃冰箱中过夜；次日取出后置于室温，PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，于37℃下孵育30 min，再经PBS冲洗5 min×3次，DAB显色5～10 min，充分水洗，苏木素液染核，脱水、透明、中性树胶封片，于镜下观察阳性细胞种类及表达情况。

免疫组化阳性标准。（1）定性分析：根据染色强度分为无棕黄色（阴性）、淡棕黄色（弱阳性）、棕黄色（阳性）、棕褐色（强阳性）。（2）半定量分析：每张切片取5个不同视野100倍显微镜下图片，经IPP（Image-Pro Plus 5.0）图像分析系统测定CK-19、MMP-7蛋白的平均光密度值（AOD=肝组织阳性细胞光密度总和/阳性面积），代表其相对表达量。

1.3 肝纤维化分级标准 根据Ohkuma'S分级标准［10］将肝脏组织纤维化程度分为Ⅰ～Ⅳ级：Ⅰ级，肝门管区轻度纤维化；Ⅱ级，临近门管区轻度桥连接纤维化；Ⅲ级，伸向临近门管区重度桥连接纤维化；Ⅳ级，肝硬化，假小叶形成。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Bonferroni法；非正态性分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，多重比较用Bonferroni法。相关性分析采用Pearson或Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 MMP-7蛋白主要表达于胆管上皮细胞、增生的胆管及汇管区周围肝细胞。G1组肝细胞呈阳性表达，胆管细胞表达强度较弱（图1A）。在移植组，胆管细胞及肝细胞表达强度增加，且胆管细胞比肝细胞表达更为强烈（图1C、E）。CK-19在胆管细胞中呈阳性表达，G2组表达强度高于其他2组（图1B、D、F）。

Fig.1 The immunohistochemical staining result of MMP-7 and CK-19 in the three groups图1 3组MMP-7和CK-19免疫组化染色结果

2.2 半定量分析结果 3组患儿肝组织内MMP-7和CK-19蛋白表达水平差异具有统计学意义，两两比较发现G2组MMP-7和CK-19蛋白表达量明显高于其余2组（P＜0.05），G1组与G3组上述蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

Tab.1 Comparison of MMP-7 and CK-19 protein expression levels in liver between three groups表1 3组患儿肝组织内MMP-7、CK-19蛋白表达水平比较（AOD，±s）

Tab.1 Comparison of MMP-7 and CK-19 protein expression levels in liver between three groups表1 3组患儿肝组织内MMP-7、CK-19蛋白表达水平比较（AOD，±s）

＊＊P＜0.01；a与G1组比较，b与G2组比较，P＜0.05

组别G1组G2组G3组F n 15 28 13 MMP-7 0.068±0.017 0.093±0.017a 0.084±0.016b 10.541＊＊CK-19 0.119±0.036 0.157±0.040a 0.110±0.044b 7.296＊＊

2.3 相关性分析 G1～G3组的纤维化程度分别为：2（2，3）vs.4（3，4）vs.4（2，4），组间差异有统计学意义（H=17.785，P＜0.01）。两两比较发现，G2组纤维化程度明显高于其余2组（P＜0.017）。将MMP-7的表达量与肝纤维化程度进行Spearman秩相关分析发现，两者呈弱正相关（rs=0.369，P=0.018），随着肝纤维化程度加重，MMP-7的表达水平升高，但MMP-7与胆管反应程度（CK-19）无明显相关性（rs=0.031，P=0.856）。

3 讨论

不同于普通肝脏疾病较为缓慢的纤维化进程，胆道闭锁肝纤维化进展迅速，是众多因素参与的复杂过程，包括肝星形细胞（HSC）活化、相关因子的过表达、细胞外基质转化（Extracellular matrix transformation，EMT）等。致病因素如病毒感染、胆闭素［11］等造成的肝脏损伤和炎症，在多种炎性因子的参与下，可激活肝星形细胞，合成、分泌大量的细胞外基质蛋白，并产生抑制基质降解的因子，导致肝纤维化甚至是肝硬化。目前研究发现多条促纤维化信号通路参与该过程：包括TGF-β/Smad、Notch、Rho/ROCK、MAPK和P13K信号通路等［12］。MMP-7作为多条促纤维化信号通路的调节蛋白及产物，同时也是各类炎症因子（如IL-17可通过调节MMP-7的活性而促进肿瘤细胞EMT过程［13］）作用于肝脏的调节因子，其与胆道闭锁肝纤维化之间的相互作用需加以重视。

3.1 MMP-7在胆道闭锁患儿中的表达 研究证实，通过对肝纤维化患者进行细胞因子、趋化因子在内的120种血清分析物和蛋白酶检测后发现，与肝脏无病变的对照组相比，有17种分析物表达呈现明显的差异，其中差异最大且最具有影响力的为MMP-7，提示MMP-7有可能参与了肝脏纤维化过程［14］。台湾的一项研究结果显示：在BA患儿中检测出MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13等的表达，发现与同年龄无肝胆疾病的患儿相比，仅MMP-2及MMP-7的表达量增高，且MMP-7的表达是MMP-2的4倍以上，故MMP-7可能是MMPs家族中参与胆道闭锁进行性肝纤维化及组织重塑的主要因子。此外，研究者运用原位杂交技术发现，MMP-7主要表达于胆管上皮细胞及肝细胞［15］。本研究同样也观察到病肝组织的胆管上皮细胞、肝细胞均有MMP-7的沉积，说明在这些部位存在局部MMP-7酶原的活化，表明MMP-7参与了BA肝纤维化过程。

国内有学者应用人类胆道闭锁肝脏组织的基因组芯片研究发现，MMPs家族多个成员表达显著异常，包括MMP-7表达上调和MMP-19表达下调［16］。此外，Kerola等［17］通过对Kasai术后自体肝生存的胆道闭锁患儿进行血清学检验及组织活检发现，MMP-7在基因和蛋白水平均表达升高，且与纤维化程度呈正相关，可作为预后的一个重要标志。同时，动物实验也发现经恒河猴轮状病毒感染后的大鼠体内可检测到高于未感染大鼠近4倍MMP-7 mRNA的高表达，且肝纤维化不同阶段MMP-7表达量不同，在进展期肝纤维化中MMP-7的表达显著增高［18］，因此提出可将MMP-7作为进展期肝纤维化及晚期肝纤维化的重要指标。笔者的研究同样也证实，随着肝纤维化程度加重，MMP-7表达量增强，对于纤维化程度较重的移植组，MMP-7蛋白在表达量及表达强度上均高于行Kasai手术时的表达。

3.2 MMP-7表达升高的可能原因 MMPs在肝纤维化过程中的作用存在相互矛盾的两方面：一方面通过降解正常的肝基底膜成份和促进HSC增生，启动并加重肝纤维化进程，另一方面又可清除部分变性的ECM，从而减缓肝纤维化进程。本研究发现，对于Kasai术后很快进展成肝硬化门脉高压而行肝移植手术的胆道闭锁患儿，其肝组织中MMP-7表达水平明显高于自体肝生存时间长的患儿。分析其可能的原因主要有以下几点：（1）TGF-β蛋白在肝纤维化早期（即Kasai手术时）的表达量明显高于肝纤维化后期（肝移植时）［19］。在肝纤维化早期，TGF-β可激活HSC合成大量的胶原，促进纤溶酶原活化抑制因子及基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的合成，抑制MMPs的合成，从而进一步扩大形成纤维化；同时HSC又可分泌大量的TGF-β，这种自分泌的正反馈机制，使得TGF-β加强肝星状细胞合成胶原的作用更加明显。而在肝纤维化后期，TGF-β表达量降低，抑制MMP-7表达的作用减弱，从而导致MMP-7表达增强。（2）肝脏可通过内平衡机制来诱导MMP-7的表达，即在肝纤维化的进程中，随着Ⅳ型胶原的过度沉积，反馈性地使MMP-7的表达增加。（3）Kasai术后肝脏未能完全解除胆道梗阻及开放胆汁引流，致使淤滞的胆汁持续作用于肝细胞及胆管细胞，从而诱导MMP-7的合成及活化，加速肝纤维化过程。

3.3 MMP-7表达与胆管增生的关系 以往的研究表明，炎症、感染等因素可使胆管上皮细胞大量增生，增生胆管可通过EMT机制转化为产生胶原成分的间充质结构，促进了纤维化的进程，可能是导致BA纤维化的重要机制［20］。有文献报道称，MMP-7的表达量与Kasai术后胆管增生程度呈正相关（r=0.454，P=0.023）［17］。在本组实验中，虽然能够观察到随着纤维化加重，胆管细胞表达MMP-7蛋白的强度增加，但并未发现两者呈明显相关性，可能与本组样本例数较少有关。

综上，MMP-7蛋白表达随肝纤维化程度加重而增强，在BA自体肝生存时间短的患儿中的表达高于Kasai术时及Kasai术后自体肝生存时间长的患儿，表明其对BA患儿肝纤维化进展具有促进作用，不利于胆道闭锁患儿Kasai术后自体肝生存。MMP-7可作为一个潜在的治疗靶点，以期能够抑制纤维化，从而达到延长自体肝生存的目的。