韩志平，张海霞，王丽君，张 琨

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同037009；2.山西大同大学设施农业技术研发中心，山西大同037009；3.山西大同大学，山西大同037009）

黄花菜（Hemerocallis citrina Bar.）属百合科萱草属多年生草本植物，是我国的特色蔬菜，其不仅营养丰富、味道鲜美，还具有药用、观赏和水土保持等方面的价值，在国内外广泛栽培[1]。甘肃庆阳、陕西大荔、山西大同、湖南祁东、江苏宿迁、浙江缙云是我国黄花菜六大主产区[2]。各地农艺工作者为了促进黄花菜产业的发展，对其栽培模式和技术进行了广泛探索，并取得了一定的成效[3-8]。但是，黄花菜种苗的生产目前仍采用分株、芽块、切片等传统繁殖方法，不仅繁殖系数低、速度慢、周期长，还容易造成品种退化，难以满足种苗大规模生产的需求，限制了黄花菜产业的快速发展[9-10]。

植物组织培养技术能在无菌条件下将离体的植物器官、组织、细胞等，在人工配制的培养基上，经过脱分化和再分化形成完整的植株[11-12]。与传统的繁殖方式相比，植物组织培养技术不仅能极大地缩短种苗的生产周期，大幅度增加繁殖系数，还能保持母本的优良性状，降低发生变异的概率，有利于实现种苗的快速繁殖、品种提纯，甚至工厂化生产[13-14]。国内早在20 世纪80 年代初就开始研究黄花菜的组织培养技术[15-17]，但至今仍没有建立起成熟的黄花菜组培体系，国外相关报道也很少[18-19]。

笔者从组织培养育苗过程、外植体选择和灭菌、培养基配方和激素对黄花菜组培效果的影响、试管苗移栽、组培常见问题等方面，综述了黄花菜组织培养的相关研究，旨在为黄花菜组培体系的建立及其在黄花菜生产中的应用提供参考。

1 黄花菜组织培养育苗过程

1.1 洗配

洗配包括组培器具准备和清洗、药品称量及培养基制备等过程[20]。培养基配制要做到药品称量准确，器具洁净，灭菌彻底。黄花菜组织培养中，MS 和N6 培养基及其1/2 剂量培养基都可以使用，其中，蔗糖2%、琼脂0.8%，pH 值5.8～6.0。工厂化育苗时可用市售白砂糖代替蔗糖，用罐头瓶取代三角瓶或组培瓶，生根培养时可用井水代替蒸馏水。

1.2 接种

接种包括外植体准备、愈伤组织诱导、继代、分化和生根时材料的接种等。各阶段材料接种时，关键是要做好器具和材料的灭菌消毒，在超净台上进行无菌操作，并随时观察，避免污染，及时接种转入下一阶段[11]。实际生产中，一个熟练工每天能接种近100 瓶，每瓶接8 个外植体[21]。

1.3 培养

培养指接种后愈伤组织的诱导、继代、芽的分化和生根培养等过程。各阶段培养基和激素的选择以形成比例高、形态正常、无污染为标准，达到某一阶段的标准后及时接种转入下一阶段培养[22]。不同外植体组织培养所经历的形态变化可能不同，要及时统计和拍照记录愈伤组织形成、胚状体、球状体以及芽、根、苗的形态、颜色、数目、大小等数据。

1.4 移苗

移苗指试管苗长到一定大小时，经过一定时间炼苗移栽到苗床，再经过一定时间的生长转移到土床进行正常管理的过程。炼苗时要注意方法和时间，移苗的苗床可以蛭石或河沙为基质，同时注意控制苗床湿度，防止试管苗腐烂死亡[23]。

2 黄花菜组织培养中外植体的选择和灭菌

2.1 外植体的选择

选择适宜的外植体是植物组织培养成功的关键之一。母株的生长状态、年龄、基因型及外植体的取材部位和时间都会影响组织培养的形态发生[24]。黄花菜的幼嫩根尖、茎段、叶片、花薹、花柄、花瓣和种子等均可作为外植体，其中以茎、叶较为常用。但是不同外植体的内部生理状态不同，诱导愈伤组织的频率、再生试管苗的难易和频率均存在明显差异，不同研究者的结果也不完全一致[21，25-26]。

苏承刚等[27]以根状茎为外植体进行组织培养，再生的幼苗长势强，但只有取春季刚长出的幼嫩根状茎才易培养。王凤翱等[28]研究发现，幼叶、花薹、花柄、花丝等均能诱导产生愈伤组织，个别材料产生了不定芽、不定根，但以花薹、花柄诱导愈伤组织的频率高。还有一些研究表明，在同种培养基上，花薹的出愈率最高，其次是花蕾、心叶，花丝、花被筒的出愈率最低[29-30]。还有研究发现，花柄的出愈率较花茎、叶片高，但花柄的出愈率与花期及花蕾大小有密切关系，且花柄的遗传稳定性较差，少数再生苗形态异常，不宜用作黄花菜组培外植体[25]。唐世建等[21]报道，花瓣再生效果明显优于心叶、花柄，花薹的诱导率最低；花瓣的诱导效果是越靠近基部越好，多层优于单层，内层优于外层；花柄的诱导效果是两端好、中间差；心叶的诱导效果与花瓣相似，也是越幼嫩效果越好，多层比单层好，里层比外层好。但是花器官只能在开花期取材，茎尖和叶片作外植体的取材时间较长、样品也较充足、产生的试管苗健壮易活，较为实用[31]。

2.2 外植体的灭菌

无菌体系的建立是组织培养成功的另一个关键环节，其中，外植体的灭菌消毒又是重中之重，直接影响组织培养能否顺利进行[24]。灭菌标准是既要彻底杀死外植体表面的微生物，又要尽可能减轻对外植体组织和细胞的伤害[32]。与其他植物相似，黄花菜组培外植体常用酒精、升汞、漂白粉等灭菌：一般先用70%酒精浸泡0.5～1.0 min，再用无菌水冲洗3～5 次；浸入0.1%升汞中10～15 min，之后用无菌水冲洗4～5 次；最后用无菌滤纸吸干，将外植体切成0.5 cm 长待用[14，31]。也可以将材料洗净并吸干水分后，用75%酒精浸泡30 s；再用饱和漂白粉溶液消毒12～15 min；而后用无菌水淋洗4～5 次；最后分割接种[17]。还可以先用洗衣粉漂洗干净；再用1%新洁尔灭浸泡15 min，或用0.1%升汞消毒8 min，或用10%次氯酸钠消毒20 min，用无菌水冲洗3～4 次；最后接种[29]。有研究表明，单独使用升汞灭菌优于单独使用酒精、新洁尔灭或漂白粉，酒精与升汞配合灭菌效果更好[30]。

3 黄花菜组培试管苗的形成途径

黄花菜组培试管苗的形成主要有4 种途径[14]：一是器官型，即直接从外植体的基部长出试管苗；二是器官发生型，即外植体先诱导产生愈伤组织，再分化形成试管苗；三是胚状体型，即外植体先诱导产生不定芽，再形成胚状体，最后分化形成胚状体苗；四是球状体型，即外植体先诱导产生愈伤组织，再形成球状体，最后分化形成苗。其中，球状体型途径出苗数量多、质量好、繁殖速度快，可作为工厂化育苗的一个有效途径[28]。

外植体种类在一定程度上决定着试管苗的形成途径。花薹、花蕾较易发生愈伤组织或不定芽，幼叶只能诱导出愈伤组织[29]。研究发现，激素水平相同时，幼叶与花药试管苗的形成途径完全不同[15]。幼叶形成试管苗的途径是器官发生型，花药形成试管苗的途径是胚状体型，花柄形成试管苗的途径既可能是胚状体型，也可能是球状体型[25，33]。韩志平等[34]研究表明，黄花菜种子胚芽端组织培养可诱导形成不定芽或愈伤组织，不定芽继续培养直接抽叶生根形成试管苗。

4 培养基和激素对黄花菜组培效果的影响

4.1 基本培养基对黄花菜组培效果的影响

对于器官发生型和球状体型2 种途径，MS 与N6 培养基对诱导愈伤组织无明显差别[21]，多数研究者使用MS 培养基。有研究表明，用MS 培养基可以诱导出胚状体[35]。但也有学者发现，激素相同时，MS培养基不能诱导胚状体，N6 培养基则能诱导形成大量胚状体，认为N6 培养基更适合诱导胚状体[33]。研究结果的差异可能与外植体、取材时间、试验条件不同有关。多数试验选用1/2 MS 培养基进行生根培养[31]。但也有研究发现，在不加激素的MS 培养基上，组培苗生根率可达95%以上，更适合进行生根培养[27]。

此外，水解酪蛋白对诱导黄花菜外植体愈伤组织有明显效果，在培养基中添加水解酪蛋白成分可使得花蕾、花薹切段发生愈伤组织，不定芽或胚状体的诱导频率明显提高[29]。董雅茹等[23]研究表明，固体培养基生根率高，但根和地上部长势不如液体培养基。液体培养基根系发达、根毛多，植株健壮，叶色深绿，移栽成活率高，同时液体培养基配制简便、成本低，用于生根培养更好。

4.2 激素种类和配比对黄花菜组培效果的影响

在不同的培养阶段，根据外植体类型和培养目的，激素种类和配比对黄花菜组培结果影响很大[36]。在愈伤组织诱导阶段，根状茎在MS＋2，4-D 0.5～1.0 mg/L＋6-BA 0.1～0.5 mg/L 培养基上，出愈率可达90%以上[27]。以心叶为外植体时，MS＋2，4-D4 mg/L的出愈率最高；花薹、花丝、花被筒为外植体时，MS＋2，4-D 2 mg/L 的出愈率最高[30]。唐世建等[21]则报道，MS＋2，4-D 2.0～2.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L 诱导心叶、花瓣、花柄、花薹形成愈伤组织的效果最好，愈伤组织数量多、质地较松散。还有学者发现，花柄切段接种在添加NAA 0.05 ～0.20 mg/kg＋6-BA 2 mg/kg、NAA 0.2 mg/kg＋KT 2 mg/kg 或KT 1 mg/kg＋2，4-D 0.5 mg/kg 的MS 培养基上，均能诱导形成愈伤组织[37]。实际操作时，应根据外植体种类，选择适宜的培养基和激素种类及其配比，从而提高愈伤组织诱导率。

继代培养阶段，培养基中激素配比又有不同。根状茎愈伤组织在MS 培养基上添加6-BA 1 mg/L＋NAA 0.01 mg/L 分化芽最好，芽分化率可达100%[27]。但也有研究表明，茎尖愈伤组织在MS＋6-BA4mg/L＋NAA 0.1 mg/L 上继代培养最好[31]。还有学者报道，以MS＋6-BA 1 mg/L＋NAA 0.1 mg/L 进行花薹、花丝、花被筒愈伤组织的芽分化效果最好[30]。唐世建等[21]研究则发现，在心叶、花薹、花瓣、花柄愈伤组织继代培养中，2，4-D 用量越大，愈伤组织越紧密，6-BA 用量越大，愈伤组织越易分化，MS＋2，4-D 2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L 为最优组合。

黄花菜组培苗常用1/2 MS 培养基添加NAA 0.2 mg/L 或IBA 0.2 mg/L 诱导生根，但在MS 培养基上，不添加激素生根率可达96%，添加NAA 后生根率明显降低[27]。也有研究发现，组培苗在不含有激素或只含有生长素的全量或半量MS 或N6 培养基上均能生根，但加入适量的NAA 可促进生根[29]。因此，在选择激素种类和浓度时，要充分考虑培养目的及基本培养基的影响。

5 黄花菜组织培养试管苗的移栽

黄花菜组培苗长出3～4 片叶、新根长1 cm 左右时要及时移苗。由于组培瓶内外环境差异较大，应先打开瓶塞，在自然温度下炼苗1～3 d，使小苗开始接触并逐渐适应外部环境。而后将试管苗从组培瓶中小心取出，洗去根上培养基，用吸水纸或纱布覆盖根部3～4 d，促使根毛发生，再将苗栽入苗床或营养钵中，可以提高移栽成活率。实验室移苗一般以蛭石为苗床基质，生产上常用河沙和泥土以体积比3∶1～4∶1 混合成苗床基质[14]。研究表明，未经灭菌的基质中组培苗成活率与灭菌的基质无明显区别，均可达到90%以上[21]。配制基质的土壤黏性要好，这样保水性较好，也可使基质表面干燥，以避免移苗后茎基部腐烂，提高组培苗的成活率，而且不需要对苗床基质灭菌，可以节约人力、物力，降低生产成本[38]。

移栽后要控制苗床温度，保持叶丛湿度。大棚内温度冬季保持15 ℃以上，夏季保持32 ℃以下，有利于组培苗的正常生长。苗成活后正常浇水施肥。小苗在苗床生长15～20 d 后，可转移到土床培育，按常规育苗技术管理。生长30 d 后，苗高达15 cm、根长达20 cm 时，即可移栽到田间正常生长。如果白天气温高、阳光太强，要选择午后或阴天移栽，并注意移栽后温度、湿度、光照等的管理，防止伤苗[17]。

6 黄花菜组织培养常见问题及其解决方法

6.1 污染问题及其解决方法

植物组织培养中经常发生接种后或继代培养后，材料或培养基污染发霉等问题。污染的原因可能是由于外植体的选择和灭菌不彻底、培养基或培养器皿消毒不彻底、超净台不达标或操作不当、环境不洁净等[22，39-40]。应特别重视材料和器具的灭菌消毒，对组织培养涉及到的各种设备、器具、培养基、外植体等采用正确、恰当的灭菌消毒方法，全面、彻底进行灭菌消毒，必要时可进行二次灭菌，对培养中发现的已污染材料要及时进行清理[41-43，26，34]。

6.2 组培苗的老化、 褐化和玻璃化问题及其解决方法

组培苗在组培瓶内时间过长，由于培养基有效成分减少，随着小苗的生长和数量的增加以及空间、光照等的变化，常会出现小苗老化，如叶色变淡、植株枯萎、生长势衰退等。为此，应适时分离继代培养，提高组培苗质量[38]。在球状体培养过程中，一旦球状体外面几层细胞出现黄褐色栓质化时，应及时割切转瓶培养，防止老化[28]。

在植物组织培养中，经常会发现外植体或培养物褐化、枯死，这种情况对外植体的脱分化和再分化有严重影响，对某些植物的组织培养起决定性作用[44-47]。影响褐化的因素有外植体的种类和生理状态、培养基的成分和激素比例、培养条件等[48-49]。通过母株和外植体的预处理[50-51]、选择适宜的培养基及培养条件[52-53]、培养基中加入防褐剂[54]、连续转移外植体[55-56]等措施可有效减少褐化发生。

在愈伤组织继代增殖过程中有时会出现少量玻璃化现象，即叶片或茎段成水渍状、半透明，叶片皱缩，脆弱易碎[57]。原因可能是由于培养环境湿度过高、温度较高、光照太弱等原因，造成呼吸和光合性能降低，影响水分、营养和CO2的吸收，从而导致生长不良和玻璃化[58-59]。发现玻璃苗应及时转瓶，置于适宜的培养环境下，增加光照强度和CO2浓度、降低培养温度，大部分可转化成正常苗[10，60]。

6.3 组培苗移栽的成活率问题及其解决方法

组培苗移栽是组织培养的最后阶段，其成活率的高低是关系到组培成败的关键问题。黄花菜组培苗生根后移栽成活率较低，主要是组培苗根系缺乏根毛，在外界自然环境下难以吸收水分和养分[28]。移栽成活率还与试管苗健壮程度、炼苗方法及时间、苗床基质、移栽后的管理等有关[61]。因此，移苗前炼苗时必须设法促使根毛发生，以提高移栽成活率。移栽基质要注意保水、保肥和通气性。研究发现，球状体苗相对健壮，容易成活，在组培过程中应尽可能诱导球状体苗。移苗要及时，移栽过迟，小苗在瓶内弯曲生长，使根与茎的极性受到影响，会出现根与苗同向生长，给移栽造成困难。成活率高低还与移栽时期有关[62]。春末夏初气温适宜、湿度较高，苗更易成活；冬季气温太低、仲夏气温过高、湿度低都不利于苗的成活和生长，若移苗需加强保温、保湿，防止高温和强光。

7 黄花菜组织培养的前景

黄花菜组织培养中存在愈伤组织诱导困难、组培苗发生途径多样、白化苗和污染较常见、组培苗移栽后成活率较低等问题。因此，目前黄花菜组织培养技术尚不成熟，加上其技术要求高、育苗成本大，至今没有在生产上推广应用。但黄花菜组织培养具有2 个明显的优点：一是取材方便，不影响生产。不同部位的幼嫩组织均能形成试管苗，取材局限性小。而且由于是多年生宿根植物，再生能力强，可重复取材，对田间生产几乎没有影响。二是繁殖系数高，速度快。外植体接种后诱导愈伤组织约需10～15 d，有的愈伤组织再经7 d 在原培养基上分化出苗，有的转移到分化培养基上经15～20 d 分化出苗。有的外植体直接产生不定芽以及胚状体，转移到光照条件下培养10～20 d 长成小苗。试管苗分离培养后又可以多种途径再次繁殖，且试管苗在组培瓶中生长很快，能在短时间内获得大量植株，繁殖系数在60 d 内可达到100 倍以上[38]。

因此，相关研究人员需要从组织培养的各个环节深入研究黄花菜组织培养体系，包括适宜的外植体及其灭菌方法、愈伤组织诱导、不定芽发生、继代、抽叶、生根等阶段培养基和激素配比，以及组培苗的促生根毛方法、玻璃化和白化苗的转变等。只有解决好这些问题才能够建立起成熟完善的黄花菜组织培养体系，为黄花菜的工厂化育苗及其在生产上的应用奠定坚实的基础，从而推动黄花菜产业的快速发展，为各产区农业结构调整和供给侧改革作出贡献。