黄 桦 朱 红 高 洁

1 蚌埠医学院检验医学院生化与分子生物学教研室 蚌埠 233030；2 蚌埠医学院第一附属医院儿科；3 蚌埠医学院第一附属医院检验科；

恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞恶变而来的一种恶性程度很高的皮肤肿瘤[1]。恶性黑素瘤不仅可发生于全身的皮肤、黏膜组织，并可随血液和淋巴转移至全身各器官。由于恶性黑素瘤的恶性程度高、易多发，且黑素瘤细胞的增殖性、侵袭性和黏附性均很强，导致恶性黑素瘤转移发生早，易转移。早期恶性黑素瘤采用手术治疗能得到较好的治疗效果，但肿瘤一旦发生转移，传统手术治疗及化疗的效果就会很差，患者的五年生存率很低[2]。

砷剂治疗恶性肿瘤的分子机理主要在于诱导肿瘤细胞分化、凋亡、自噬、抑制肿瘤细胞增殖、影响肿瘤组织血管生成等。有报道[3-6]称，砷剂诱导凋亡的机理与干扰细胞线粒体呼吸链活性、降低线粒体跨膜电位、增加细胞内活性氧水平、阻滞细胞周期、活化Caspase家族蛋白、下调NF-κB及Survivin等蛋白的表达和抑制细胞端粒酶活性等密切相关。但应用砷剂治疗恶性黑素瘤的实验研究国内外文献报道较少。本研究选用小鼠B16细胞株为研究对象，探讨不同浓度的As2O3对细胞凋亡及p53、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响，探讨As2O3引起恶性黑素瘤细胞凋亡的分子机理。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 B16细胞株(购自中科院细胞所)，胰蛋白酶，RPMI-1640培养基，胎牛血清(美国GIBCO公司)，As2O3(美国SIGMA公司)，吖啶橙(上海生工生物工程技术服务有限公司)，Bcl-2蛋白和Bax蛋白兔抗鼠多克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)，p53蛋白和GAPDH蛋白羊抗鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)。

1.2 细胞培养和分组 B16细胞贴壁培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，1～2 d传代一次。取对数生长期细胞，用含2.0 g/L胰酶和0.5 mmol/L EDTA的培养液进行消化，利用细胞计数盘调整细胞终浓度为1.5×108/L，然后继续培养24 h至细胞处于对数生长期，将细胞分为三组，有两组分别换入As2O3终浓度分别为10、20 mmol/L的培养液，对照组不加药，再继续培养24 h。

1.3 细胞形态观察 分别采用吖啶橙染色(acridine orange，AO，5 mg/mL)和吉姆萨染色镜下观察对照组和10、20 mmol/L As2O3作用下B16细胞形态的变化。

1.4 Western blot检测p53、Bax、Bcl-2蛋白的表达 采用细胞裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白，并检测蛋白含量。取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜。封闭液封闭2 h，4℃条件下一抗(1∶1 000)孵育过夜，洗涤后再加入相应二抗，37 ℃条件下孵育2 h。以GAPDH为内参照，将目标条带与GAPDH条带 的吸光度比值作为相应蛋白表达水平。

1.5 统计学方法 数据均以(均数±标准差)表示，采用SPSS 16.0行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吉姆萨染色观察细胞形态 倒置显微镜下可见对照组细胞正常贴壁生长，细胞形态基本一致，呈梭形；而药物处理组的细胞形态由梭形变为圆形。同时，20 μmol/L As2O3组的漂浮细胞较10 mmol/LAs2O3组的多，而贴壁细胞则出现减少的趋势且细胞内颗粒增多。从图1可见吉姆萨染色显示对照组B16细胞核呈圆形，细胞生长排列紧密且有交错层叠现象。经10 μmol/L As2O3作用后的B16细胞形态及生长速度未受到显著影响。经20 μmol/L As2O3作用后的B16细胞形态逐渐变得不规则，同时细胞变小，相等视野下细胞数量减少。

A 对照组；B 10 μmol/L As2O3作用24 h组；C 20 μmol/L As2O3作用24 h组。

图1 吉姆萨染色观察As2O3作用后B16细胞形态变化(×400)

2.2 吖啶橙染色观察细胞形态学变化 吖啶橙染色结果显示对照组细胞核形态规则且完整，在镜下呈均匀绿染；经10 μmol/L As2O3作用后细胞核形态未见受到显著影响；20 μmol/L As2O3作用后的B16细胞的细胞核均有破裂，核质浓缩等现象。细胞核呈不规则的、大小不等、致密浓染的黄绿色颗粒状或块状荧光(图2)。

A 对照组；B 10 μmol/L As2O3作用24 h组；C 20 μmol/L As2O3作用24 h组。

图2 吖啶橙染色观察As2O3作用后B16细胞的形态学变化(×200)

2.3 Western blot检测p53、Bax、Bcl-2蛋白表达 Western blot检测相关蛋白表达变化可见，与对照组相比，As2O3作用后，B16细胞中p53、Bax蛋白的表达上调，Bcl-2蛋白的表达下调(图3)。

p53蛋白的相对光密度比值在对照组、10 μmol / L As2O3组、20 μmol / L As2O3组分别是5.04±0.73、12.41±1.31、22.21±1.26；Bcl-2蛋白的相对光密度比值在上述三组中分别是45.53±1.29、25.33±1.23、10.38±1.25；Bax蛋白的相对光密度比值在上述三组中分别是29.63±0.57、35.32±0.56、44.17±1.01。三组之间进行两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

1 对照组；2 10 μmol/L As2O3作用24 h组；3 20 μmol/L As2O3作用24 h组。

图3 Western blot检测As2O3作用后B16细胞的p53、Bcl-2、Bax蛋白表达变化

图4 Western blot检测As2O3作用后B16细胞的p53、Bcl-2、Bax蛋白与GAPDH的相对光密度比值

注：*P<0.05；**P<0.01。

3 讨论

砷在自然界中主要以与氧或硫结合的形式存在，其主要毒理机制在于与巯基的亲和力很强，可影响体内多种酶的活性，特别是参与细胞能量代谢及DNA合成与修复的酶。在历史上，砷留给人们的印象更多的是一种毒物；但是我国学者却打破传统认知，应用砷剂作为抗肿瘤药物临床治疗白血病，并且取得了较好的疗效[7]。同时，As2O3对其他肿瘤是否也有类似作用，这也是人们感兴趣的问题。目前，有其他研究报道，As2O3可以引起人乳腺癌细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、鼻咽癌细胞等肿瘤细胞的凋亡和自噬，并抑制其增殖[8-10]。

细胞凋亡是一种程序性死亡，在这一过程中机体主动清除多余细胞和“缺陷”细胞。细胞凋亡对机体发育和自身稳定均起到重要作用，是机体的一种重要防御机制。细胞凋亡异常是肿瘤发生的重要机制。在正常机体中，细胞增殖和凋亡之间维持着一种平衡。而一旦细胞增殖和凋亡之间的平衡遭到破坏，细胞凋亡受到抑制，肿瘤便会迅速生长。对肿瘤进行的各种治疗归根结底均与抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡有关。本课题组前期的研究结果表明，As2O3可以抑制小鼠恶性黑素瘤的生长。但不同浓度的As2O3其诱导细胞凋亡作用不尽相同，其中较高剂量的As2O3对B16细胞诱导凋亡作用较强，而低剂量的As2O3则效果不显著[11]。细胞凋亡的显著特征之一就是细胞核的形态发生一系列的改变，本次实验结果表明，As2O3作用B16细胞后，会引起B16细胞的细胞核形态发生一系列的改变。

肿瘤细胞的生长增殖过程受到多种因素的调控。常见的肿瘤抑制基因有p53、Bax、Caspase等，原癌基因有Bcl-2、NF-κB、Survivin等。Caspase家族蛋白是目前已知最强的促凋亡蛋白。引发Caspase级联反应，继而产生凋亡的重要机制之一就是，本来位于线粒体中的细胞色素C在多种因素的作用下，从线粒体中释放出来，刺激凋亡体的形成，进而激活Caspase家族。Bcl-2是目前已知的重要的抗凋亡蛋白，其发挥抗凋亡作用的机制之一就是阻止细胞色素C从线粒体释放出来；同时，作为与Bcl-2属于同一蛋白家族的Bax却是促凋亡蛋白，能够对Bcl-2 产生阻抑作用。Bax可以形成寡聚体，从细胞浆中转移到线粒体膜上，和Bcl-2形成多聚体，增强线粒体的通透性，最终诱导细胞色素C从线粒体中释放，产生促进凋亡作用。p53可以诱导Bax的表达，以及抑制Bcl-2的表达，进而使得线粒体内膜两侧的电位差消失，线粒体膜通透性增加，导致细胞色素C从线粒体中释放出来，促进细胞凋亡。已有研究[12]报道，As2O3能够通过影响p53、Bcl-2、Bax等多种凋亡相关因子的表达，诱导结肠癌等肿瘤细胞的凋亡。通过对小鼠正常黑色素细胞和B16细胞转录组表达的比较可以看出，NF-κB、Bcl-2、Bax等蛋白mRNA的表达差异显著[13]。而本次实验结果表明，As2O3可使B16细胞株p53、Bax蛋白的表达增加，Bcl-2蛋白的表达下降。

As2O3作用于B16细胞后会引起细胞核形态发生一系列的改变，同时诱导p53、Bax蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达。在小鼠正常黑色素细胞和B16细胞之间，上述三种蛋白的表达差异显著，所以上述三种蛋白在恶性黑素瘤的肿瘤进程中占有重要的地位。本次研究的结果将为临床治疗恶性黑素瘤和开发砷剂药物提供进一步的理论和实验基础。