王诗玮 纪琪 朱天辉

摘要 ：为筛选出对常用有机磷杀虫剂敌敌畏具有较强耐药性的莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi突变菌株，本文通过紫外线照射诱变莱氏绿僵菌，并利用敌敌畏对紫外突变菌株进行4次药剂理化诱变，并对突变株进行了抗性水平、遗传稳定性测定，得出敌敌畏对莱氏绿僵菌孢子的致死浓度为1 291 mg/L，适合莱氏绿僵菌紫外线诱变的最佳照射时间为2 min和2.5 min，得到6株能耐1 291 mg/L敌敌畏的突变菌株，其中突变株Nr UVY6的抗性水平是出发菌株的2.57倍，抗药性遗传稳定性也最佳。

关键词 ：紫外线诱变; 莱氏绿僵菌; 敌敌畏; 药剂理化诱变; 耐药性

中图分类号：

S 476.11

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018465

Resistance of Metarhizium rileyi UV mutation to dichlorvos

WANG Shiwei， JI Qi， ZHU Tianhui

（College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Wenjiang 611130， China）

Abstract

In order to screen out the mutant strain of Metarhizium rileyi which is highly resistant to dichlorvos， a common organophosphate insecticide. The M. rileyi strain mutagenized by ultraviolet irradiation， and DDVP was used to domesticate the mutant strain for 4 times. The resistance level and genetic stability of the mutant were determined. The lethal concentration of dichlorvos against the spores of M.rileyi was 1 291 mg/L， and the optimal durations fort UV irradiation were 2 min and 2.5 min. Six mutant strains resistant to 1 291 mg/L DDVP were obtained. The resistance level of the mutant strain Nr UVY6 was 2.57 times higher than the original strain， and the genetic stability of the drug resistance was also the best.

Key words

UV mutagenesis; Metarhizium rileyi; dichlorvos; drug mutagenesis; drug resistance

萊氏野村菌Metarhizium rileyi现已更名为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi，是一种重要的昆虫病原真菌。据不完全统计，其对40多种鳞翅目昆虫具有致病性，尤其对夜蛾科害虫具有较强的致病性。在各类昆虫病原物（包括细菌、病毒和线虫等）中，真菌是唯一能通过表皮侵入昆虫的病原微生物，其在害虫生物防控中具有重要作用[1]。通常使用的方法是以孢子悬浮液的形式喷施到农作物或者林木上或以土壤缓释的方式来感染靶标害虫。周立峰等发现莱氏绿僵菌Nr15菌株对斜纹夜蛾的田间侵染率超过90%，有着巨大的应用潜力[2]。此外，它对人体和其他非靶标生物包括昆虫、寄生虫和天敌无毒，不仅具有较高的实用价值而且在环境中能自然降解，是一种高效、环保的实用生防菌。

但在实际应用中，多种杀虫剂都对莱氏绿僵菌菌丝的生长或孢子的形成具有一定的抑制作用[3]。邱思鑫等[4]对使用20种常用杀虫剂对莱氏绿僵菌孢子萌发和菌丝生长造成的影响进行了测定，结果表明，60%的杀虫剂对孢子萌发抑制率达50%以上，说明大多数杀虫剂对莱氏绿僵菌孢子的形成有一定的抑制作用，其中敌敌畏的抑制率高达8868%。试验结果同时表明各杀虫剂对莱氏绿僵菌的菌丝生长有不同程度的抑制作用，其中有机磷类的5种杀虫剂抑制率均较高。综合治理可以兼具化学农药和虫生真菌双方的优点，要使微生物杀虫剂在存在杀虫剂的速效性时兼具莱氏绿僵菌的持效性，从而在控制病虫害的前提下大幅度减少化学杀虫剂的施用量，进而获取经济和环境效益的双赢，最有效的措施就是对莱氏绿僵菌进行诱变。

采用人工诱变和基因工程手段可以获得抗药性生防菌株，但目前基因工程改造生防菌的技术还不是很成熟，操作技术难度较大，只有少数种类获得成功[5]。物理诱变中的紫外线诱变因其作用时间长、效果好、突变随机性强，可在短时间内获得大量突变体等优势，在诱变育种工作中得到大量运用[67]。由于复合诱变效果优于单因子诱变，因此，本试验主要采用紫外线诱变和含敌敌畏培养基理化诱变相结合的方法，以不同浓度敌敌畏对突变株及继代培养菌株的生长影响来对突变株的抗药性水平进行初步评价。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 出发菌株

莱氏绿僵菌出发菌株由四川农业大学森林保护学科实验室提供。

1.1.2 试剂

蛋白胨，杭州微生物试剂有限公司;无水葡萄糖，西陇科学股份有限公司;琼脂，上海伊卡生物技术有限公司;吐温80，成都市科龙化工试剂厂;77.5%敌敌畏乳油，漯河科瑞达生物科技有限公司;无水乙醇，成都市科隆化学品有限公司;甘油，四川西陇化工有限公司;酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3 培养基

PDA培养基[8]、PPDA培养基[9]、SMAY培养基[9]，均为自然pH。

1.2 试验方法

1.2.1 原始菌株扩繁

将莱氏绿僵菌原始菌株转接到PPDA斜面培养基上进行扩繁，在温度27℃、相对湿度95%、光照条件L∥D=12 h∥12 h的恒温光照培养箱中培养7～15 d，于冰箱4℃保存备用。

1.2.2 制备孢子悬浮液

将试管保存的莱氏绿僵菌菌株接种在 PDA培养基上，收集孢子，用无菌的0.05%（V/V）吐温80水溶液反复冲洗孢子，倒入无菌三角瓶，经27℃恒温磁力搅拌器搅拌60 min使孢子分散活化，用脱脂棉或者无菌滤纸过滤掉菌丝和杂质，得到较纯的孢子悬浮液，再稀释成约102～103个/mL孢子悬浮液。

1.2.3 敌敌畏对莱氏绿僵菌孢子致死浓度的测定

将77.5%的敌敌畏乳油稀释10倍后再稀释1 600、1 200、800、600、400倍（稀释后浓度为484、646、968、1 291、1 937 mg/L）分别加入到培养基中，并制成不同浓度的含药平板，每个浓度设3个重复。吸取0.1 mL莱氏绿僵菌孢子悬浮液均匀涂布于含药平板上，以不加敌敌畏的PDA平板为对照，置于27℃恒温培养箱中，培养3～5 d后逐日观察菌落生长情况。在前一个较低浓度平板上长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落，后一浓度即为敌敌畏对莱氏绿僵菌出发菌株孢子的致死浓度。

1.2.4 紫外线诱变最佳照射时间的确定

吸取0.1 mL孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上，然后打开皿盖置于已预热30 min的16 W暗箱三用紫外分析仪内进行紫外线照射，照射距离为16 cm，波长254 nm。诱变时间从0.5～20 min分次分梯度设置，以不经紫外线照射的孢子悬浮液涂布培养平板为对照，所有处理均设3个重复。试验操作全程避光。48 h后視生长情况逐日统计菌落数并计算紫外诱变后的致死率，并以致死率在70%～80%确定最佳的紫外线照射时间。致死率按下式计算：

致死率=

未经诱变处理组菌落数-诱变处理组菌落数未经诱变处理组菌落数×100%。

1.2.5 紫外线多次重复诱变

以试验所得的最佳紫外线照射时间为诱变时间进行多次循环诱变，每次以前一次诱变后产生的菌落直径大于出发菌株且产孢快、孢子丰富、无污染的突变株为材料做成孢子悬浮液，同样涂抹于平板上进行紫外线照射得到下一代突变株，如此重复，直到突变株的菌落直径与上一代突变株相比无明显增加时即结束诱变。对最终诱变所得的突变株进行编号、保存。

1.2.6 抗敌敌畏突变株的筛选

将经过紫外诱变后得到的突变株产生的孢子制成孢子悬浮液。以77.5%敌敌畏乳油有效成分浓度968 mg/L作为初始药剂理化诱变浓度进行紫外线诱变加药剂理化诱变，吸取0.1 mL孢子悬浮液涂布于含敌敌畏968 mg/L的培养基平板上，16 W紫外灯下诱变2.5 min，每处理重复3次，避光培养5～7 d，期间逐日观察记载菌落生长情况。凡是在平板上长出菌落的，即为抗敌敌畏968 mg/L的突变菌株。挑取菌落直径大、孢子丰富、产孢快的单菌落继续进行紫外线诱变和更高浓度的含药培养基理化诱变，通过多次理化诱变，逐步提高药剂浓度直到在含敌敌畏3 875 mg/L的培养基上长出菌株。选择菌落直径大、产孢快、孢子丰富的单菌落保存。

1.2.7 突变株对敌敌畏的抗性水平测定

采用菌丝生长抑制率法[1011]测定莱氏绿僵菌突变株对敌敌畏的抗性水平。将原出发菌株和突变株Nr UVY1、Nr UVY6培养10 d后，移接到含敌敌畏1 600、1 200、800、600、400、300、200倍稀释液（浓度分别为484、646、968、1 291、1 937、2 583、3 875 mg/L）的PDA平板中央，以不加敌敌畏为对照，每个处理设3个重复，置于温度27℃、相对湿度在95%、光照条件L∥D=12 h∥12 h的恒温光照培养箱中培养，每个处理重复3次。10 d后，待莱氏绿僵菌生长稳定后，用十字交叉法测量各处理的菌落直径，并计算出各菌株的抑制率值、EC50以及抗性水平。

抑制率=（对照菌落数-处理菌落数）/对照菌落数×100%;

抗性水平： 抗性比=突变株EC50/出发菌株EC50。

1.2.8 突变菌株的遗传稳定性测定

将经紫外线诱变和含药培养基理化诱变后获得的高抗性突变株制成孢子悬浮液，分别接种于含敌敌畏浓度为突变菌株最高耐药浓度的含药培养基和空白培养基上，27℃恒温培养，连续转接7代，每隔8 d转接1次。观察菌株在含药培养基上的生长状况，并用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次，计算敌敌畏对各代突变株的生长抑制率并绘制各突变株相对应的遗传稳定性图表。

2 结果与分析

2.1 敌敌畏对莱氏绿僵菌孢子的致死浓度

对照组接种2 d后即有菌落产生，随后绿色分生孢子很快布满平板并覆盖了菌丝;在敌敌畏浓度为484、646 mg/L的含药平板上第3天开始有菌落产生，随后绿色分生孢子逐渐产生;在浓度为968、1 291 mg/L的含药平板上第5天才见有菌落长出，7 d后才见产孢，和前几组处理相比，这两种浓度处理下的菌落更小、孢子更少，且在含敌敌畏1 291 mg/L处理中分生孢子产量锐减，到第10天也只有几个小菌落，而在敌敌畏浓度1 937 mg/L的含药平板上第10天也未见有菌落产生，由此表明，浓度1 291 mg/L为敌敌畏对莱氏绿僵菌出发菌株孢子的致死浓度，并以此为抗药性致死突变标志。

2.2 紫外线诱变

2.2.1 紫外线照射时间的确定

由表1可知，莱氏绿僵菌孢子经紫外线照射10 min時死亡率已达92.47%，紫外线照射15 min 和20 min 后，莱氏绿僵菌的死亡率均为95.21%，说明15 min以后的照射最多影响长势，对存活尚无明显影响。当紫外线波长、功率、照射距离等条件一定时，致死率随照射时间（即紫外线照射剂量）的增加而增加，且在0～5 min这一时间段内的死亡率增加最快，照射5 min时莱氏绿僵菌的死亡率已接近90%。由于5～20 min照射的致死率均不在70%～80%之间，故重新进行第2次紫外线诱变，结果见表2。

表2同样显示随着紫外线照射时间的增加，莱氏绿僵菌的死亡率也增加，当照射0.5 min时，死亡率仅63.01%，而照射3 min时，致死率已达82.88%。经计算，在0～0.5 min这一时间段内，莱氏绿僵菌的死亡率增加最快，0.5 min之后死亡率上升趋势较平稳，到3 min时死亡率已超过80%。根据要求需要选择致死率在70%～80%之间的，故2 min和2.5 min均为适合莱氏绿僵菌的紫外照射时间。为统一标准，后续试验均采用紫外线照射2.5 min进行诱变。

2.2.2 多次重复诱变

经测定，出发菌株的菌落直径平均为11.50 mm，经过第1次2.5 min紫外线照射后，挑选出了28个产孢快、孢子丰富、平均菌落直径为15.25 mm的正突变株做成孢子悬浮液进行第2次紫外线诱变;经过第2次紫外线诱变后又筛选出了产孢较快、孢子丰富、平均菌落直径为18.75 mm的6个单菌落，将这6个单菌落制成孢子悬浮液进行第2次紫外线诱变后，长出来的单菌落中没有同时满足直径大于18.75 mm，且产孢快、孢子丰富这两个筛选条件的，说明从表观看诱变效果已无明显增加。因此，将第2次诱变后获得的6株突变株分别编号为Nr UVY1、Nr UVY2、Nr UVY3、Nr UVY4、Nr UVY5、Nr UVY6。

2.3 抗敌敌畏突变株的筛选

分别将紫外诱变突变株Nr UVY1、Nr UVY2、Nr UVY3、Nr UVY4、Nr UVY5、Nr UVY6配制成107个/mL浓度的孢子悬浮液，在不同浓度敌敌畏含药平板上进行第1次药剂理化诱变，理化诱变结果如表3。

1） 表中“+”代表菌株能生长，“-”代表菌株不能生长。下同。

+， the strains can grow;-， the strains cannot grow. The same below.

从表3可以看出，6株紫外突变株经过第1次药剂理化诱变后在敌敌畏浓度为968 mg/L的含药培养基均能生长;在出发菌株的致死浓度1 291 mg/L的含药培养基上，除了Nr UVY2、Nr UVY5两株不能生长，其余4株突变株均能生长;在浓度大于1 291 mg/L的平板上，6株突变株均无法生长。

选择能在含1 291 mg/L敌敌畏的含药培养基上生长的突变株Nr UVY1、Nr UVY3、Nr UVY4、Nr UVY6，挑取菌落直径大、产孢快的单菌落做成孢子悬浮液，在含药平板上继续进行第2次药剂诱变，结果如表4。

从表4可以看出，4株突变株在敌敌畏致死浓度1 291 mg/L的含药培养基上都可以生长且正常产孢;在含药浓度为1 937 mg/L的平板上除了Nr UVY3不能生长，原来在此浓度下不能生长的突变株Nr UVY1、Nr UVY4、Nr UVY6均可以生长且产孢，突变株Nr UVY6同样长势最好、产孢较快;在更高浓度的2 583 mg/L含药平板上只有Nr UVY6能生长但产孢较少、菌落直径小;而在浓度大于2 583 mg/L的所有含药平板上均未见菌落出现。因此，选择能在1 937 mg/L的含药平板上生长的Nr UVY1、Nr UVY4、Nr UVY6继续进行第3次药剂理化诱变，同样挑取菌落直径大、产孢快的单菌落做成孢子悬浮液，在含药平板上进行理化诱变，理化诱变结果见表5。

从表5可以看出，3株突变株在含敌敌畏浓度1 937 mg/L的平板上均能够生长，而在含敌敌畏2 583 mg/L的培养基上，突变株Nr UVY6仍然能够生长;原来不能在此浓度下生长的突变株Nr UVY1也可以生长且正常产孢，但长势不如突变株Nr UVY6;在含敌敌畏3 875 mg/L的培养基上，原来经过第2次理化诱变后不能在此浓度下生长的突变株Nr UVY1、Nr UVY6现在可以生长，而Nr UVY4依然不能生长;在浓度大于3 875 mg/L的含药平板上均未见菌落生长。因此选择能在含药浓度为3 875 mg/L的平板上生长的突变株Nr UVY1、 Nr UVY6进行第4次药剂诱变，结果如表6。

表6显示，突变株Nr UVY1、Nr UVY6经过第4次理化诱变后，与第3次的结果一样，依然不能在含敌敌畏5 166和7 750 mg/L的平板上生长，说明诱变效果已无明显正突变，因此3 875 mg/L即为所有突变株对敌敌畏的最高耐药浓度，Nr UVY1、Nr UVY6即为筛选到的抗药性突变株。

2.4 突变株对敌敌畏的抗性水平

由表7可知，未经诱变的出发菌株的EC50最小，为851 mg/L，与2株突变株的EC50在0.05水平上有显著差异，但突变株Nr UVY1和Nr UVY6之间无显著性差异。经过诱变处理的两株突变株对敌敌畏的抗性水平不同。突变株 Nr UVY1对敌敌畏的抗药性稍弱，抗性比为2.22，其EC50为1 888 mg/L;而突变株Nr UVY6对敌敌畏的抗药性较强，抗性比为2.57，EC50为2 184 mg/L。突变株Nr UVY6的抗性水平高于突变株Nr UVY1，并且2个突变株的抗性水平都高于出发菌株，说明经过紫外线诱变加药剂理化诱变后莱氏绿僵菌对敌敌畏的抗药性明显提高。

1） 采用Duncan氏多重分析法比较，同列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著（P<0.05，N=3）。

Different letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level by using Duncans multi analysis method （P<0.05， N=3）.

2.5 突變株的遗传稳定性

从表8可以看出，突变株Nr UVY1和Nr UVY6经过连续转接7代后，敌敌畏对2株突变株的生长抑制率差异不大，说明经过紫外线诱变加药剂理化诱变后得到的突变株Nr UVY1、Nr UVY6对敌敌畏的抗药性遗传基本稳定。随着转接代数的增加，可以看出敌敌畏对突变株Nr UVY1的生长抑制率缓慢增加，增加幅度明显大于突变株Nr UVY6，说明突变株Nr UVY6的遗传稳定性更好。因此，无论从对敌敌畏的抗性水平还是遗传稳定性来看，突变株Nr UVY6均优于Nr UVY1。

3 讨论

试验通过莱氏绿僵菌出发菌株在含不同浓度敌敌畏平板上的生长情况对比得出敌敌畏对莱氏绿僵菌孢子的致死浓度为1 291 mg/L，这与邱思鑫等[4]得出的80%敌敌畏乳油1 000倍稀释液对莱氏绿僵菌孢子萌发的抑制率达88.68%的结果有一定出入，分析原因可能有两个： 一是不同地域、不同寄主的莱氏绿僵菌由于生物学性状不同造成对杀虫剂的耐受性不同。龙亚飞等[12]曾对来自河南、山东、安徽的莱氏绿僵菌菌株对农用多抗霉素的敏感性进行过测定，结果表明来自安徽和山东的莱氏绿僵菌菌株对农用多抗霉素比较敏感，而来自河南的莱氏绿僵菌菌株则对农用多抗霉素具有较强的抗药性。邱思鑫所用试验菌株分离自福州郊区蔬菜地斜纹夜蛾，而本试验所用菌株分离自大邑县杜仲种植基地自然感染莱氏绿僵菌而死的杜仲梦尼夜蛾，因此，不同地域的莱氏绿僵菌对同一农药的敏感性不尽相同。二是化学农药的长期使用已经使得一些生防菌对化学农药产生了一定的抗药性，实际上长期的农药选择压力也是提高菌株耐药性的一种方法，但是因为其周期较长而不被使用。而敌敌畏等有机磷杀虫剂在以往的长期使用中，对人类、动植物以及生态环境带来了诸多负面影响。因此有必要通过诱变手段提高莱氏绿僵菌的耐药性，为莱氏绿僵菌在田间的推广使用打下基础。

本试验以经过紫外线诱变后致死率在70%～80%之间为标准，得出了适合莱氏绿僵菌紫外线诱变的最佳照射时间为2 min和2.5 min;经过两次紫外线照射后筛选出了6株产孢较快，孢子丰富，平均菌落直径为18.75 mm的突变株，分别编号为Nr UVY1、Nr UVY2、Nr UVY3、Nr UVY4、Nr UVY5、Nr UVY6。

由于紫外线照射时其波长主要集中在255 nm附近，这与多数细菌的DNA 吸收光谱相一致[13]， 所以紫外线在使真菌发生诱变的同时还对细菌具有较强的致死作用，大大减少了真菌培养过程中被细菌污染的概率，是一种理想的诱变方式。但由于紫外线作用位点的随机性，诱变带来的效果也是随机的，可能发生正突变，也可能发生负突变。比如王兴民等[14]对玫烟色棒束孢进行紫外线诱变后，结果显示经过不同时间的紫外线照射后，玫烟色棒束孢sp.1菌株的菌落生长和产孢量存在一定差异，有些处理的菌落直径和产孢量大于出发菌株，有些则小于出发菌株。彭燕[15]对放线菌BM10、许天委[16]对金龟子绿僵菌MA4进行紫外线诱变的结果显示处理后的菌落直径和产孢量也存在不同差异，需要对莱氏绿僵菌出发菌株进行进一步的药剂诱变以得到稳定的抗药性突变株。

现已有许多学者采用紫外线加药剂诱变的方式提高了出发菌株对农药的耐药性[1718]。本试验经过2次紫外线诱变加4次药剂理化诱变后，筛选得到了能在含敌敌畏浓度为3 875 mg/L的平板上生长的突变株Nr UVY1和Nr UVY6。突变株Nr UVY1、Nr UVY6的抗性水平分别是出发菌株的222倍、2.57倍，说明莱氏绿僵菌经过紫外线加药剂理化诱变后对敌敌畏的耐药性有所提高。但与拮抗性木霉[19]经紫外线诱变加药剂诱变后耐药性提高100多倍、哈茨木霉[20]经诱变后耐药性提高300多倍、金龟子绿僵菌[16]经诱变后耐药性提高120倍的结果相比较，莱氏绿僵菌诱变后耐药性提高的效果远不如上述几种生防菌。分析原因可能有以下两个： 第一是诱变时间较短。本试验统一采用2.5 min作为诱变时间，而哈茨木霉、拮抗木霉均经过80 min的诱变。试验发现致死和变异作用并非同一过程的平行效应[21]，即高剂量的诱变虽然会增加菌株的变异几率，但其弊端是造成的损伤大且负突变比例较高，不利于目标菌株的分离筛选;而低剂量的诱变则相反，它造成的损伤较小且正突变比例较高，有利于目标菌株的分离筛选，但其弊端就是突变几率降低，因此诱变效果随之较低;第二则可能是莱氏绿僵菌自身基因稳定性所决定。有研究表明[22]，金龟子绿僵菌经诱变后产生的不同抗药性可能是由于编码β 微管蛋白的相应基因发生了突变，在不同位点的突变表现了不同的抗药水平，因此对莱氏绿僵菌发生突变的位点进行更深入的研究将有助于解释为何莱氏绿僵菌经过紫外线诱变加药剂诱变后其抗药性提高幅度不如上述几种生防菌。

突变株Nr UVY1和Nr UVY6经过连续转接7代后，对敌敌畏的抗药性遗传均基本稳定，说明莱氏绿僵菌在经过紫外线诱变加药剂诱变后产生抗药性的相关基因位点比较稳定，对相关基因位点的研究、相关基因的克隆将有助于阐释莱氏绿僵菌抗药遗传稳定性的分子机制，为莱氏绿僵菌在农林生产中的长期应用奠定理论基础。

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（责任编辑：田 喆）