王蒙蒙 白 鹰△ 郎明非

1)大连大学附属新华医院，辽宁 大连 116021 2)大连大学医学院，辽宁 大连 116622

脑卒中是导致死亡和严重的长期残疾的主要原因[1-3]。目前，该病的诊断主要依赖于临床症状和神经影像学技术[4-5]。然而在实际的临床工作中仍存在一定的局限性，使得缺血性脑卒中在发病后没有被识别。因此迫切需要提高缺血性脑卒中诊断的速度和准确性。通过外周血检测生物指标，是一种无创或较小创伤的疾病诊断方法。此方法不仅可以快速的诊断疾病的发生，同时还可减轻病患疼痛[6-7]。与此同时，外泌体源性miRNA作为近年的研究热点之一，在脑卒中相关方面的研究有了突破性的的进展。

外泌体最早在1983年被提出，PAN等[8-9]在红细胞上清液的研究过程中发现囊状小泡的存在。目前关于外泌体的认识更加深入，随着机体病理生理的改变，外泌体中包含大量的、种类繁多的miRNA、mRNA、siRNA等生物活性物质也随之发生相应的变化[10-11]。越来越多的实验研究证明，外泌体源性miRNA多方面影响着脑血管以及神经系统的发生发展，在缺血性脑卒中的发生发展中发挥着重要的作用[12-13]。其中较为显著的发现是，在疾病的发生发展过程中存在外泌体源性miRNA表达水平的特异性改变[14-16]。由此可见外泌体源性miRNA 作为生物标志物用于诊断和预后具有很大的潜能。因此本研究选取外泌体源性miR-451作为研究对象，探索其作为缺血性脑卒中临床诊断标志物的可能性。

1 资料与方法

1．1一般资料收集2017-5—2018-05大连大学附属新华医院神经内科的缺血性脑卒中患者的血液标本30例，男14例，女16例。纳入标准：(1)缺血性脑卒中的诊断符合2014 年中华医学会缺血性脑血管病诊疗指南的标准；(2)患者发病24 h 内入院，且未行机械取栓或动静脉溶栓治疗。排除标准：(1)既往有脑卒中史；(2)合并严重心、肝、肾疾病及肿瘤等。本研究经过医院伦理委员会同意，且参与者均签署知情同意书。

1．2方法

1．2．1 血清中外泌体的分离：用miRNaeasy Serum/Plasma Kit(购于QIAGEN 公司)方法提取血清中的外泌体，通过Trizol(购于Takara 公司)的方法，裂解外泌体并提取其中全部的RNA，去除RNA 中的gDNA，以PrimeScriptTM RT reagent kit(购于Takara 公司)逆转录全部RNA 为cDNA。反应条件：42 ℃孵化15 min，85 ℃孵化5 s。

1．2．2 miR-451表达的检测：通过SYBR 荧光(购于Takara 公司)实时定量PCR 技术，按照试剂盒说明书的反应体系，检测血清外泌体中miR-451 的表达。采用两步法的反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃延伸30 s，共40 个循环；溶解曲线。CEL-39 作为内参对照。并使用2-△△Ct方法计算各组中miR-451 的表达量。

2 结果

2．1不同组间患者基本资料的比较患者的临床基线特征，如年龄、性别、糖尿病、高血压、高血脂等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2．2不同组间血清外泌体中miR-451表达比较相对于对照组，缺血性脑卒中患者发病后1 d与7 d组血清外泌体中miR-451的表达显著升高，相对表达量分别为1.07±0.45，19.74±14.53，17.31±11.36。见图1。

2．3血清外泌体中miR-451作为缺血性脑卒中临床诊断标志物的价值ROC曲线分析结果显示，缺血性脑卒中发病后1 d组血清外泌体中miR-451 AUC=1(P<0.001)，取相对表达值1为截断点，灵敏度为100%，特异度为100%。缺血性脑卒中发病后7 d组，血清外泌体中miR-451 AUC=1(P<0.001)，取相对表达值1为截断点，灵敏度为100%，特异度为100%。见图2。

3 讨论

脑卒中是我国第三大常见的死亡原因，也是世界范围内最常见的致残原因。而缺血性脑卒中是最常见类型[17-18]。其准确的临床诊断一直是临床医生十分关注的问题。虽然当前关于缺血性脑卒中的医学影像技术在不断的发展，但因最新的成像技术操作复杂及费用高昂而在某种程度上未做到完全普及[19-21]。此外，影像学检查对于区分陈旧性缺血灶和新发缺血灶存在着一定的局限性。相对而言，血液标志物检测具有非创伤性、快速及经济等优点，有希望通过寻找到有效的生物标志物，应用于各种疾病的诊断或预后判断等。外泌体可广泛的分布于人体各种体液中，在血液、尿液、唾液等均可被检测[22]。外泌体在细胞间通讯中发挥重要作用，广泛参与人体的各种生理和病理进展。缺血性脑卒中发生后，外泌体可以被合成并从脑卒中反应细胞中释放出来，能够通过血脑屏障，可以在外周血或脑脊液中检测到，反映脑卒中病理进展[23]。此外，外泌体具有相对稳定的结构，可以保护其内容物免受破坏，因此可以通过检测所携带的核酸、脂质、蛋白质等多种生物成分来判断疾病的状态，是一种可靠的潜在生物标志物[24-25]。实验研究证明，外周血中的miRNA主要被包裹于外泌体中，可作为一项重要的观察指标[26]。在缺血性脑卒中发生后，会有多种外泌体源性的miRNA发生变化，或上调或下调，其表达水平与疾病病理生理学相关[27-28]。然而针对缺血性脑卒中诊断的血液外泌体源性miRNA标志物尚不清楚。

在生物体中，DNA首先编码生成pre-miRNA，经过一系列的酶切过程形成20nt左右的单链RNA即miRNA，与AGO结合形成有活性的RISC[29-30]。与mRNA的3’非编码区(3’UTR)的2-8个碱基互补，成为种子区域，依据互补的完全性在翻译过程分别引起mRNA降解或多肽链的脱落[31-33]。在针对脑卒中患者的研究中，据报道大概有超过20%的脑卒中存在miRNA的变化，因此研究者认识到miRNA与脑卒中之间有着紧密的联系，进而开展了大量的实验研究，并得到客观的研究成果。

表1 2组基本资料比较Table 1 Comparison of basic data between two groups

注：A：缺血性脑卒中发病后1 d组外泌体源性miR-451的ROC曲线；B：缺血性脑卒中发病后7 d组外泌体源性miR-451的ROC曲线

通过创建脑卒中模型进行实验发现，较假手术组，模型构建24 h后血清中的miR-124浓度升高150倍。可知脑卒中疾病发生后miR-124具有含量丰富的特点[34-35]。而且还有实验表明，miR-124还有可能作为颅脑损伤严重程度分型的标志物[36-38]。所以，作为一种生物标记，miR-124有很大的研究价值。此外，经证实，不同的miRNA在脑卒中的发生发展过程中起着不同的功能作用。在缺血性脑提取物中发现，骨髓干细胞分泌的外泌体大量增加，携带的miR-133b被输送到星形胶质细胞和神经元，增加轴突生长[39]；DA等[40]通过甲酚紫染色证明mir-122能明显的减小脑卒中的梗死面积，以及改善小鼠的生物学行为；用去除胶实验和错步实验来分析功能恢复情况，通过实验组和对照组之间的比较发现miR-133b很大程度提高了神经恢复[41]。

关于miR-451的研究发现，其与缺血、神经系统疾病有着紧密的联系。在低压低氧的模型中，经证实血清中miR-451的表达明显上调[42]。在心肌细胞缺血再灌注性损伤模型中，miR-451通过抑制HMGB1 mRNA增加心肌细胞的存活率、降低凋亡率[43-45]。与此同时，miR-451可通过下调Rac-1基因的表达，调节急性缺血引起的氧自由基的生成[46-47]。此外，在肺缺血再灌注模型中，miR-451的下调可促进AKT信号通路的激活，进而减少细胞凋亡，起到对肺组织的保护作用[48-49]。在神经系统疾病中，目前已知miRNA-451靶向调控p38MAPK，减轻脑微血管损伤、促进血管再生以及调节炎症反应[50]；关于miRNA-451在疾病中的表达，一方面，在外伤性路脑损伤时，miRNA-451的表达升高[51]；另一方面，miRNA-451有希望成为脑卒中后认知障碍的一种分析指标[52]。然而关于miRNA-451作为缺血性脑卒中的生物标志物的可能性目前仍不清楚。

因此，我们探索了外周血外泌体源性的miR-451在缺血性脑卒中的潜在预测价值。在本研究中，我们分析了来自缺血性脑卒中患者和对照组的血液标本，由图1可知，缺血性脑卒中的发病前后，外泌体源性miR-451的表达水平发生了变化。与对照组相比，缺血性脑卒中发病后，外泌体源性的miR-451表达显著增加。此外，本研究分别计算缺血性脑卒中患者发病后第1天和第7天的ROC曲线，AUC均为1，表明人群中100%受试者被正确诊断，可见血清外泌体源性的miR-451有可能是一种优秀的缺血性脑卒中临床诊断的生物标志物。

但由于本研究选取的样本容量较少，如需广泛的应用于临床工作中，尚需更大规模的临床试验研究进行更深入的探讨，明确外周血外泌体中miR-451作为缺血性脑卒中的临床诊断指标的可能性。另一方面，本研究选取了缺血性脑卒中发病后的1天和7天两个时间点，这两个时间点中外周血外泌体中miR-451的表达无统计学意义，而在这段时间中miR-451的表达情况仍需进一步的深入探索。