叶 婷，崔雅萍，梁林金，梁文仪，简 平，周 坤，吴玲芳，李 师，亓 旗，张兰珍

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

大三果由诃子、毛诃子和余甘子3味药组成，3种果实常配伍使用，或以它们为主药配伍为三果汤散，三果汤等剂型，故简称大三果[1]。大三果最早见于藏医药《四部医典》[2]，1995年版藏药部颁标准将其收载[3]。隋唐时期经印度传入我国，据记载，大三果已被用于印度传统医学超过1000余年。在阿育吠陀传统医学中，大三果可以促进疾病的恢复与痊愈，具有保健作用，应用十分广泛[4-6]。大三果主要含有鞣质类、酚酸类、三萜酸类及黄酮类等化合物，现代药理研究发现大三果在抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗菌、抗炎、强心、保肝、化疗保护等方面均表现出一定的治疗和预防保健作用[7-11]。2015版中国药典将没食子酸作为指标来评价余甘子的质量，而对诃子、毛诃子无明确的质量控制的指标性成分，有学者对诃子[12，13]、毛诃子[14，15]及余甘子[16-18]采用HPLC法对其药材中的多个成分（没食子酸、鞣花酸、柯里拉京等）的含量进行测定，也有学者采用HPLC法同时测定三果汤水提物中没食子酸、柯里拉京、鞣花酸的含量[19]。本文建立分光光度法测定总鞣质及HPLC法同时测定大三果及其鞣质部位中没食子酸、柯里拉京和鞣花酸等3个成分含量的方法，为大三果及鞣质部位的质量控制提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器

仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪；Agilent chemstation b.04.03软件；十万分之一电子分析天平：Sartorious BT 25S型（北京赛多利斯仪器有限公司）；超声波清洗器（功率：100 W，型号：KQ-500DE昆山超声仪器有限公司）；紫外-可见分光光度计：TU1810（普析通用公司）；EYELA旋转蒸发仪（日本，型号：N-1000）。

表1 流动相梯度

图1 供试品与对照品HPLC谱图

1.2 材料

药材：余甘子、诃子和毛诃子药材均购自北京藏医院（产地尼泊尔），经北京中医药大学生药系阎玉凝教授鉴定，分别为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.、使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.及毗黎勒 Terminalia bellirica（Gaertn.）Rox.的干燥成熟果实。没食子酸对照品（批号17022801）、柯里拉京对照品（批号17033002）、鞣花酸对照品（批号17052603），均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%。

试剂：甲醇（Fisher Scientific，色谱纯）；蒸馏水（屈臣氏）；其他试剂均为分析纯。磷钼钨酸试液（自制）；29%碳酸钠溶液。

2 方法与结果

2.1 HPLC含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备

没食子酸对照品溶液：精密称取没食子酸对照品4.55 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液。

柯里拉京对照品溶液：精密称取柯里拉京对照品3.45 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为柯里拉京对照品溶液。

鞣花酸对照品溶液：精密称取鞣花酸对照品2.08 mg于25 mL容量瓶中，加少量二甲亚砜溶解并用50%甲醇稀释至刻度，作为鞣花酸对照品溶液。

混合对照品溶液：精密吸取等量上述对照品溶液，混匀，制成混合对照品。

2.1.2 大三果及其鞣质部位供试品溶液的制备

大三果供试品溶液：按1∶1∶1比例称取三种药材，混合，粉碎（过50目筛），混匀，为大三果供试品。取大三果粉末300 mg，精密称定，置100 mL三角瓶中，精密加入50%甲醇60 mL，称重，超声60 min，补足减失重量，滤过，取续滤液，即得。

大三果鞣质部位供试品溶液：采用课题组建立的提取纯化方法，取一定量等比例余甘子、诃子以及毛诃子药材，粉碎，提取，过大孔树脂纯化，洗脱液回收至小体积，减压干燥，即得大三果鞣质部位。取大三果鞣质部位粉末21 mg，精密称定，精密移取60 mL 50%甲醇置100 mL三角瓶中100 MHz超声60 min，补足原重量，滤过，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 高效液相色谱条件

Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相A（甲醇）：（B）0.1%甲酸水，其梯度（表1）；流速为1 mL·min-1；检测波长：270 nm。分别吸取混合对照品溶液、大三果药材供试品溶液和大三果鞣质部位供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，按下列流动相梯度洗脱，色谱图（图1）。

2.1.4 线性关系考察

分别精密吸取没食子酸对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL；柯里拉京对照品溶液4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL；鞣花酸对照品溶液4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、32 μL注入液相色谱仪。按照“2.1.3液相色谱条件”项下方法测定峰面积，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，计算3种成分的回归方程（表2）。

2.1.5精密度试验

精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，按照“2.1.3液相色谱条件”记录峰面积，没食子酸、柯里拉京和鞣花酸色谱峰峰面积的RSD分别为0.59%、0.85%和0.30%，表明该方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

大三果供试品溶液制备后分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 进行测定，记录峰面积，没食子酸、柯里拉京和鞣花酸色谱峰峰面积的RSD值分别为0.32%，0.73%，0.33%。样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

取大三果药材粉末供试品300 mg，6份，精密称定，按照“大三果供试品溶液的制备”项方法制备，按照“2.1.3液相色谱条件”项下方法进行含量测定。没食子酸、柯里拉京和鞣花酸的平均含量分别为1.69%、0.58%和0.99%，RSD值分别为为0.96%、1.41%和1.37%。表明该方法重复性良好。

2.1.8 回收率试验

2.1.8.1 大三果药材加样回收率试验

取大三果供试品150 mg，共6份，精密称定，分别精密加入对照品溶液没食子酸（2.53 mg·mL-1）柯里拉京（0.87 mg·mL-1），鞣花酸（1.5 mg·mL-1）1.0 mL，精密加入50%甲醇57 mL置100 mL三角瓶中，超声60 min，补足失去重量，滤过，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜滤过。精密吸取供试品20 μL，按照“2.1.3液相色谱条件”项下测定峰面积，计算回收率及RSD值（表3）。

表2 3种成分线性关系考察

2.1.8.2 鞣质部位加样回收率试验

分别精密称取没食子酸3.3 mg置100 mL容量瓶中，柯里拉京对照品4.5 mg置于25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容。精密称取鞣花酸对照品3.75 mg置于25 mL容量瓶中，加DMSO溶解，以50%甲醇稀释并定容。

称取大三果鞣质部位粉末6份，每份约10.5 mg，分别向每一份样品中精密加入上述对照品溶液各1.0 mL，50%甲醇定容至10 mL，摇匀，滤过，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜过滤，精密吸取20 μL进样，测定没食子酸、柯里拉京和鞣花酸色谱峰峰面积，计算回收率及RSD值（表4）。

表3 大三果药材加样回收率考察结果

表4 大三果鞣质部位加样回收率考察结果

表5 不同批次大三果药材单一成分含量测定结果（n=3）

表6 不同批次鞣质部位3种成分含量测定结果（n=3）

2.1.9 不同批次大三果药材和鞣质部位中指标性成分的含量测定

称取3个批次大三果药材供试品粉末300 mg，精密称定，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，按“2.1.3 高效液相色谱条件”，测定峰面积，计算含量（表5）。

称取三个批次鞣质部位粉末约21 mg，精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解后，定容至刻度，摇匀，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤，进样20 μL，按“2.1.3高效液相色谱条件”测定峰面积，计算含量，结果（表6）。

2.2 总鞣质含量测定（2015版中国药典方法）

2.2.1 溶液制备

磷钼钨酸试液：按2015版药典第四部通则8001试药部分方法，取钨酸钠100 g、钼酸钠25 g，加水700 mL使溶解，加盐酸100 mL磷酸50 mL，加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂150 g、水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去残留的溴（约15 min），冷却，加水稀释至1000 mL，滤过，即得。本液不得显绿色（如放置后变为绿色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多涂的溴即可）。

29%碳酸钠溶液：取29 g碳酸钠溶于100 mL蒸馏水或10.8 g无水碳酸钠溶于100 mL蒸馏水中即得。

对照品溶液：称取没食子酸对照品约5 mg精密称定，置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

大三果供试品溶液：取大三果供试品300 mg，精密称定，置250 mL平底烧瓶中，精密加入60%乙醇150 mL，称重。50℃温浸提取12 h，冷却至室温，60%乙醇补足原重量，滤过，作为供试品溶液。

大三果鞣质部位供试品溶液：取鞣质部位粉末约34 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶，60%乙醇溶解，定容，摇匀，备用。

表7 大三果药材加样回收率试验结果

表8 大三果鞣质部位加样回收率试验结果

显色方法：供试液2 mL置25 mL容量瓶中，加入1 mL磷钼钨酸试液，再加去离子水10 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，在760 nm的波长处测定吸光度。

2.2.2 显色稳定性考察

精密吸取干酪素吸附前后溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”显色，测定吸光度。每隔10 min测定一次，结果显示，静置显色20 min后反应充分，在20 min到180 min之内稳定，溶液吸附前后的吸光度RSD值分别为0.4%和0.25%

2.2.3 磷钼钨酸比色法测定波长的选择

分别精密吸取没食子酸对照品溶液和大三果样品干酪素吸附前后溶液各2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.1”显色，摇匀，暗处放置30 min，400-900 nm范围内扫描测定吸收光谱。显色后全波长扫描图，λMAX为760±2 nm。

2.2.4 干酪素用量考察

精密吸取供试品溶液25 mL，分别加入不同量干酪素0.4 g，0.6 g，0.8 g，1 g和1.2 g，每组平行2份，按供试品含量测定法测定含量，结果表明加入0.8 g干酪素测定鞣质的含量较为稳定，故选择干酪素用量为0.8 g。

2.2.5 线性关系考察

精密吸取没食子酸对照品溶液（0.0504 mg·mL-1）0.5、1、2、3、4、5 mL，置25 mL容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.5 mL、11 mL、10 mL、9 mL、8 mL、7 mL，按“2.2.1”显色，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程：Y=116.53X+0.0309，r=0.9991，没食子酸在1.008-10.08 μg·mL-1范围内线性良好。

2.2.6 精密度考察

精密吸取干酪素吸附前后溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，连续测定6次，RSD分别为0.12%，0.32%，该方法精密度良好。

2.2.7 重复性考察

称取大三果样品300 mg 6份，精密称定，“2.2.10”项方法制备供试品溶液，显色测定吸光度，计算鞣质成分的含量。RSD为0.51%，该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性考察

按2.2.1制备供试品溶液，分别于0，10 min，20 min，30 min，60 min，90 min，120 min精密吸取干酪素吸附前后溶液各2 mL，按“2.2.10”项下方法测定吸光度，计算鞣质类成分的含量。RSD为0.30%，样品溶液在8 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率试验

大三果药材加样回收率试验：称取6份大三果药材粉末（过50目筛），各150 mg，精密称定，分别精密加入没食子酸对照品溶液6 mL（6 mg·mL-1），置250 mL平底烧瓶中，精密加入60%乙醇150 mL，称重。50℃温浸提取12 h，冷却至室温，用60%乙醇补足原重量，过滤过，取续滤液，按“2.2.10”项下方法测定吸光度，计算鞣质含量，计算平均加样回收率为（表7）。

表9 大三果药材和鞣质部位鞣质含量测定结果（n=3）

大三果鞣质部位加样回收率试验：称取6份大三果鞣质部位粉末约17 mg，精密称定。分别精密加入1 mL没食子酸对照溶液（9.35 mg·mL-1），置于50 mL容量瓶。60%乙醇溶解后，定容至刻度，按“2.2.10”项下方法测定鞣质含量，计算加样回收率（表8）。

2.2.10 总鞣质含量测定

总酚测定：取3个批次大三果供试品300 mg，精密称定，按“2.2.1”项下制备供试品溶液。取2 mL，移入25 mL容量瓶，照“2.2.1”显色方法显色，测定吸光度。

不被吸附的多酚精密量取供试品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.8 g的100 mL具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.1方法显色，测定吸光度。计算鞣质含量，结果(表9)。

精密称取3个批次大三果鞣质部位粉末约34 mg置于50 mL容量瓶。60%乙醇溶解，定容，摇匀，作为测定不被吸附多酚的样品溶液。按药材鞣质含量测定方法测定总酚和不被吸附多酚，测定吸光度，计算总鞣质含量，结果（表9）。

3 讨论

以各成分含量为指标对供试品的制备方法（提取方法、提取溶剂、提取时间等）进行了考察，结果显示其在50%甲醇中可以完全溶解，样品出峰佳。对不同厂家干酪素（北京奥博星生物技术有限责任公司、北京博奥拓达科技有限公司及北京索莱宝科技有限公司）空白干扰试验考察结果表明干酪素水浸出液中，含有干扰试验物质；不同生产厂及批号的干酪素，干扰试验物质含量有明显差异。故“不被吸附多酚”测定中，应采用同生产厂家、同批号的干酪素做空白试验。

本文主要观察大三果药材与其鞣质部位中3种特征性成分及总鞣质含量综合评价大三果的质量。方法稳定性高、重复性好，结果准确，可为大三果的质量控制方法研究提供参考。