彭丹 ，宋丽 ，陈泽慧 ，董泽令 ，周小仙 ，陈安林 ，李亚男

（1.遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563000；2.遵义医学院，贵州 遵义 563003）

鞣质联合环丙沙星对鲍曼不动杆菌生物膜形成的影响*

彭丹1，宋丽2，陈泽慧1，董泽令1，周小仙2，陈安林1，李亚男2

（1.遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563000；2.遵义医学院，贵州 遵义 563003）

目的 研究石榴皮提取物鞣质联合环丙沙星（CIP）对鲍曼不动杆菌（Ab）生物膜形成的影响。方法采用2倍稀释法测得石榴皮提取物鞣质和CIP对Ab ATCC19606的最低抑菌浓度（MIC）；将1/2MIC、MIC、2MIC浓度的鞣质和CIP单独及联合用药作用于Ab生物膜4、8、24和48 h，采用结晶紫法和荧光显微镜法观察生物膜的形成。结果 鞣质和CIP对Ab的MIC值为1.95和0.50 mg/ml；联合用药较单独用药对Ab生物膜的形成影响大，且2MIC鞣质+2MIC CIP联合作用24 h，对生物膜形成影响最大。结论 石榴皮提取物鞣质和CIP联合用药对生物膜形成的影响比单独用药明显，且2MIC鞣质+2CIP联合用药对Ab生物膜作用24 h影响效果最佳。

鲍曼不动杆菌；生物膜；石榴皮提取物鞣质；环丙沙星

鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumanni，Ab）为革兰阴性非发酵菌，广泛存在于自然界、医院环境及健康人的皮肤；该菌生存力及黏附力极强，可长期定植于医院，易形成生物膜，使耐药性大大增加，导致感染难以控制[1]。生物膜是细菌生长过程中为适应环境的一种优势生存方式。生物膜一旦形成，保护细菌不受抗菌药物和消毒剂的影响，其膜内细菌耐药性比浮游菌增加10～1 000倍[2]。如今，新开发一种抗生素周期长，不利于感染的控制，而且西药容易产生耐药，那么寻找新的治疗方案刻不容缓。我国中草药资源丰富，来源范围广、价格便宜、毒副作用小、不轻易产生耐药性、在病原体内有多方面的作用及药效，为西药抗菌药物之后的一个新药方向。相关文献报道，五倍子、大蒜素、苦参等中药影响细菌生物膜[3-5]。鞣质是石榴皮主要成分，主要药理作用是收敛、抗菌，本实验将研究其是否对生物膜有破坏作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 实验菌株：鲍曼不动杆菌ATCC1 9606；质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923，以上购自上海宝录生物有限公司。

1.1.2 药物 石榴皮购自遵义树林大药房，经遵义医学院附属医院药剂科鉴定为合格品；环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）购自上海生工生物工程有限公司。1.1.3 主要仪器及试剂 日本Olympus荧光显微镜，法国梅里埃公司的VITEK2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析仪、配套药敏卡，北京百灵威科技有限公司结晶紫，美国Thermo酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 鞣质的提取及原液的制备 石榴皮粉碎后，经过加热回流法提取鞣质，粗提物分别经5%三氯化铁乙醇溶液和紫外分光光度计做定性和定量检测，按照2010版药典以没食子酸的含量作为质控标准；鞣质提取成功后，称取0.1875 g溶于3 ml M-H肉汤中，配制浓度为62.50 mg/ml。

1.2.2 鞣质对Ab最低抑菌浓度的测定 将Ab ATCC19606配制成0.5麦氏菌液浓度，然后将菌液稀释100倍；准备8支无菌试管，1～6号试管分别加入1 ml肉汤，将1 ml鞣质原液加入1号试管，混匀后再吸出1 ml于第2管，依次进行2倍稀释，6号管吸出1 ml弃去；7号管作为阴性对照，8号管为阳性对照，进行孵育培养，观察最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.3 CIP原液的配制 使用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪，使用大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC259 23进行质控，用药敏卡检测CIP对Ab的药敏结果，根据其敏感范围（＜1μg/μl），称取 0.04 g CIP，溶于10ml M-H肉汤当中，配制浓度为4mg/ml CIP溶液。

1.2.4 CIP对Ab的MIC测定 将Ab ATCC19606配制成0.5麦氏菌液浓度，然后将菌液稀释100倍；准备8支无菌试管，1～6号试管分别加入1 ml肉汤，将1 ml CIP原液加入1号试管，混匀后再吸出1 ml于第2管，依次进行2倍稀释，6号管吸出1 ml弃去；7号管作为阴性对照，8号管为阳性对照，进行孵育培养，观察MIC值。

1.2.5 生物膜的建立 吸取一定量菌液浓度为1×106CFU/ml的Ab加入孔板内，37℃静置培养48 h，形成生物膜。

1.2.6 结晶紫微孔板法 将形成生物膜的孔板内加入 100 μl 1/2MIC、1MIC、2MIC 鞣质溶液，1/2MIC、1MIC、2MIC的CIP溶液，以及联合用药鞣质和CIP各50 μl，100 μl PBS 为对照组，37℃分别培养 4、8、24和48 h，在相应的时间将抗菌药物吸出，清洗掉抗菌药物；每孔加入200 μl 0.25 g/L结晶紫染液，染色20 min，洗掉多余的染液；每孔加入200 μl 95%乙醇脱色15 min，酶标仪检测微孔板在570 nm处的光密度值。

1.2.7 FITC-ConA标记显微镜技术 将形成生物膜的孔板中加入1ml 1/2MIC、1MIC、2MIC鞣质溶液，1/2MIC、1MIC、2MIC 的 CIP 溶液，以及联合用药鞣质和CIP各0.5 ml。对照孔加入1 ml无菌PBS溶液，37℃培养24 h；用50 μl FITC-ConA荧光染料染色，在荧光显微镜波长为480 nm处观察不同浓度鞣质和CIP对Ab生物膜形成的影响。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鞣质和CIP对Ab的MIC值

石榴皮提取物鞣质和CIP对Ab ATCC19696的MIC分别为1.95和和0.50 mg/ml。

2.2 鞣质和CIP对Ab已形成生物膜的破坏作用

2.2.1 结晶紫微孔板法结果 各组4、8、24和48 h对生物膜形成影响比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。单用组对形成的生物膜作用4 h后，与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；单用组作用8 h后，不同浓度的CIP与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而不同浓度的鞣质单用组与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；单用组分别作用24和48 h后，不同浓度的鞣质、CIP单用组与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度的鞣质和CIP联合组对Ab生物膜的影响，与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着药物浓度逐渐增加，光密度值逐渐降低，其中以2MIC鞣质+2MIC CIP组作用24 h效果最好。见附表和图1。

附表 不同药物组合对Ab生物膜形成的影响 （±s）

附表 不同药物组合对Ab生物膜形成的影响 （±s）

注：1）与空白组比较，P ＜0.05；2）与鞣质、CIP 单用组比较，P ＜0.05

组别 4 h 8 h 24 h 48 h空白组 2.01±0.24 2.15±0.13 2.20±0.42 2.23±0.48 1/2MIC鞣质组 1.71±0.28 1.76±0.251） 1.63±0.141） 1.65±0.231）MIC鞣质组 1.58±0.43 1.54±0.511） 1.53±0.221） 1.62±0.171）2MIC鞣质组 1.62±0.18 1.68±0.181） 1.66±0.451） 1.58±0.281）1/2MIC CIP组 1.94±0.31 1.90±0.18 1.71±0.301） 1.73±0.321）MIC CIP组 1.87±0.17 1.88±0.16 1.76±0.191） 1.86±0.311）2MIC CIP组 1.90±0.42 1.94±0.41 1.74±0.251） 1.63±0.181）1/2MIC鞣质 +1/2MIC CIP 组 1.45±0.441）2） 1.43±0.471）2） 1.33±0.331）2） 1.23±0.381）2）1/2MIC 鞣质 +MIC CIP 组 1.45±0.141）2） 1.36±0.401）2） 1.34±0.341）2） 1.15±0.141）2）1/2MIC鞣质 +2MIC CIP 组 1.30±0.251）2） 1.31±0.161）2） 1.21±0.381）2） 1.11±0.321）2）MIC鞣质 +1/2MIC CIP 组 1.14±0.301）2） 1.12±0.281）2） 0.73±0.191）2） 0.72±0.241）2）MIC鞣质 +MIC CIP 组 1.08±0.141）2） 1.06±0.341）2） 0.76±0.241）2） 0.66±0.261）2）MIC鞣质 +2MIC CIP 组 1.03±0.291）2） 1.03±0.251）2） 0.65±0.351）2） 0.68±0.171）2）2MIC鞣质 +1/2MIC CIP 组 0.87±0.111）2） 0.85±0.271）2） 0.51±0.221）2） 0.53±0.301）2）2MIC 鞣质 +MIC CIP 组 0.83±0.271）2） 0.84±0.331）2） 0.48±0.131）2） 0.49±0.161）2）2MIC 鞣质 +2MIC CIP 组 0.76±0.141）2） 0.72±0.141）2） 0.40±0.171）2） 0.46±0.11）2）F值 1602.32 820.61 478.50 520.13 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 不同药物组合对Ab生物膜形成的影响

2.2.2 FITC-ConA标记显微镜技术结果 不同浓度的鞣质和CIP单用及联合用药对Ab生物膜作用24 h后，经FITC-ConA荧光染色后在荧光显微镜480 nm处观察细菌生物膜的形成情况。空白组、不同浓度鞣质和CIP单用，显微镜下均可见大片明亮绿色荧光；当1/2MIC鞣质与不同浓度CIP联用后，可见较疏松的绿色荧光；1MIC鞣质与不同浓度CIP联用后，可见筛网状绿色荧光；2MIC鞣质与不同浓度的CIP联用后，绿色荧光明显减少，以2MIC鞣质与2MIC CIP联用作用最明显。见图2。

图2 不同药物组合对Ab生物膜形成的影响（荧光显微镜×400）

3 讨论

近年来Ab发病率和致病率日趋增多，且对多种抗菌药物耐药，其主要的原因之一是产生生物膜。有研究表明，Ab的耐药性与生物膜的产生密切相关，膜内细菌耐药性比浮游菌增加10～1 000倍，给临床抗感染带来极大挑战和困难[6]。目前使用较为广泛的药物就是抗生素，但是单独使用某种抗生素，Ab很快出现耐药；而且新开发一种抗生素周期长，很不利于感染的控制，联合用药成为目前首选方案。石榴皮提取物鞣质，具有收敛、抗菌作用。本课题组前期研究发现鞣质对Ab具有较好的抑菌效果；CIP为合成的第3代喹诺酮类，为治疗Ab感染常用药物。国内学者殷网虎等[7]研究白藜芦醇对Ab生物膜具有破坏作用；史鹏等[8]研究得出抗菌肽LL-37对Ab生物膜具有破坏作用；国外学者LUÍS等[9]研究没食子酸、咖啡酸及绿原酸对葡萄球菌生物膜的破坏作用；ALVES等[10]研究芫荽精油成分对Ab生物膜的影响。

本实验通过结晶紫微孔板法和FITC-ConA标记显微镜技术，探讨石榴皮提取物鞣质与CIP单独及联合用药对生物膜的作用。在结晶紫微孔板法中，单用组对生物膜作用4h后，与空白组比较无差异；单用组作用8 h后，不同浓度的CIP单用组与空白组比较无差异，不同浓度的鞣质单用组比较有差异；单用组在分别作用24和48 h后，不同浓度的鞣质和CIP单用组与空白组比较有差异。不同浓度的鞣质和CIP联用对Ab生物膜形成，与空白组比较有差异。联合用药对生物膜形成影响较为明显。FITC-ConA标记显微镜技术结果标明，空白组、不同浓度鞣质和CIP单用，显微镜下均可见大片明亮绿色荧光；当1/2 MIC鞣质与不同浓度的CIP联用后，可见较疏松的绿色荧光；1MIC鞣质与不同浓度的CIP联用后，可见筛网状绿色荧光；2MIC鞣质与不同浓度的CIP联用后，绿色荧光明显减少，以2MIC鞣质与2MIC CIP联用作用最明显。联合用药对生物膜影响明显。

本研究只进行了体外实验，以后还需进行体内实验，最终为控制Ab的感染提供科学依据。

[1]LONGO F,VUOTTO C,DONELLIG.Biofilm formationin Acinetobacter baumannii[J].New Microbiol,2014,37(2):119-127.

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[7]殷网虎,曹美林,李佳,等.白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用研究[J].中国中医急症,2016,25(6):1011-1013.

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[10]ALVES S,DUARTE A,SOUSA S,et al.Study of the major essential oil compounds of coriandrum sativum against acinetobacter baumannii and the effect of linalool on adhesion,biofilms and quorum sensing[J].Biofouling,2016,32(2):155-165.

Tannin combination with Ciprofloxacin could effect on biofilm ofAcinetobacter baumanni*

Dan Peng1,Li Song2,Ze-hui Chen1,Ze-ling Dong1,Xiao-xian Zhou2,An-lin Chen1,Ya-nan Li2
(1.The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China;2.Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,China)

Objective To explore the effect of tannin extracted from Pomegranaterind combined with Ciprofloxacin (CIP)on thebiofilm ofAcinetobacterbaumanni (Ab).MethodsTheminimalinhibitory concentrations (MIC)of tannin and CIP to Ab ATCC19606 were determined by broth dilution method.The 1/2MIC,MIC and 2MIC of tannin,CIP and their combination acted on Ab for 4,8,24 and 48 h,respectively;then the biofilm formation of Ab was observed by crystal violet staining assay and fluorescence microscopy.Results The MIC of tannin and CIP to Ab ATCC19606 were 1.95 mg/ml and 0.50 mg/ml respectively.The effect of tannin or CIP separately on the biofilm of Ab was weaker than that of their combination.And their combination could have some effect on the biofilms,of which the combined use of 2MIC tannin and 2MIC CIP for 24 h had the greatest effect on biofilm formation of Ab.Conclusions Combined use of tannin extracted fromPomegranaterind and CIP has more obvious effect on the biofilm formation of Ab,moreover,the combination of 2MIC tannin and 2MIC CIP for 24 h has the best effect.

Acinetobacter baumanni;biofilm;tannin extracted fromPomegranaterind;Ciprofloxacin

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.006

1005-8982（2017）26-0030-05

2017-01-04

贵州省科技厅合作计划[No：黔科合 LH（2015）7480）]；遵义医学院基金[No：院字（2009）22 号][

陈泽慧，E-mail：941291773@qq.com

（童颖丹 编辑）