费静 王长黎 李雷激

1西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科（四川泸州 646000）；2自贡市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科（四川自贡643000）

面瘫是临床常见病，属于针灸的Ⅰ级病谱［1］且疗效确切［2］，但具体机制尚不明确。神经元胞体是整个神经元的营养中心，是损伤后神经功能恢复的基础［3］。严重的周围面神经损伤，会引起中枢面神经运动神经元的凋亡［4］。面神经损伤后的修复是多因素综合作用的结果。细胞信号分子如神经营养因子、细胞因子、黏附分子等在面神经再生中发挥着至关重要的作用。上皮钙黏素（E⁃cadherin，E⁃cad）属钙黏素超家族黏附分子，其生物功能的发挥需要第二信使Ca2+的参与［5］，通过直接的黏附作用在神经元修复过程中参与细胞稳态的维持和信号传递。钙调素（calmodulin，CaM）是最重要的钙调蛋白，通过与Ca2+的特异性结合，促进DNA、mRNA等遗传物质的合成，从而促进细胞的分裂再生［6］。

关于E⁃cad和CaM在周围神经再生过程中是否发挥作用，以及电针通过上述两种分子介导的周围面神经再生的作用方式和途径，目前国内外均未见相关文献报道。本实验就该问题提出设想，试图揭示E⁃cad和CaM在周围神经再生过程中的功能以及两者之间的关系，以进一步探索穴位电针治疗周围性面瘫的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型建立新西兰大白兔52只，6～8个月龄，体质量（2.5± 0.25）kg，雌雄不限，由西南医科大学实验动物中心提供［许可证号：SCXK（川）2013⁃17］，经西南医科大学动物伦理委员会审批。将其随机分成正常组（4只）、手术组（24只）和电针组（24只）。正常组不作任何处理；手术组、电针组均制作右侧面神经上颊支压榨性损伤的病理摸型［7］：3%戊巴比妥钠腹腔麻醉动物，取右耳屏前至下颌角下缘作“S”形切口，钝性分离出面神经上颊支，止血钳全钳夹持面神经颊支30 s，松开30 s，再钳夹30 s，钳夹的总时间为1 min，钳夹部分的面神经长约2 cm，手术显微镜下观察，损伤程度符合Sunderland损伤Ⅳ度。缝合切口、复苏、分笼饲养，预防感染。

1.2 电针干预手术组于造模后不作治疗，自然康复。电针组术后2 h开始行穴位电针干预。取穴［7］：翳风：下颌升支后缘中点向后0.5 cm。颊车；咬肌最隆起之处。四白：眶下孔下方0.5 cm。地仓：口角外侧1.0 cm。阳白：眶上缘中点以上约1.0 cm。颧缪：经外眦垂线之颧骨颞突下缘凹陷处。穴位配对：翳风-颧缪、颊车-地仓、阳白-四白。采用0.25 mm×0.25 mm无菌毫针，按上述穴位配对连接青岛鑫升G6805⁃1A型治疗仪，设置治疗参数：电压2 V，频率18～20 Hz，疏密波，由低频往高频调，以颊肌轻微颤动且实验动物能忍受的程度为宜。治疗时长为30 min，每天1次。

1.3 取材正常组直接取材；手术组和电针组分别于术后1、4、7、14、21、28 d取材（每组在各时间点取4只）。RT⁃qPCR取材方法：耳缘静脉注射空气处死动物，离断兔头，剪开头骨，颞骨向外侧骨折，保留右侧位听神经根作为术侧标记。于冰台上去除小脑四叠体，从脑桥上缘开始至脑桥下缘3 mm切取脑桥组织，分为3块，每块厚度≤3 mm，-80℃冰箱冻存。切片标本的取材方法：腹腔麻醉动物后经腹切口暴露腹主动脉后结扎，剪开胸骨，进入胸腔，0.9%生理盐水500 mL经心灌注至右心房流出液不含血性液，继续灌注4%多聚甲醛400 mL作预固定。依RT⁃qPCR取材方法获得含面神经元的脑干组织，10%福尔马林固定24 h。

1.4 HE染色HE试剂盒（G1120，Solarbio）。按以下顺序操作：组织蜡块切片→脱蜡水化→自来水5 min→苏木素10 min→自来水5 min→氯化氢无水乙醇15 s→自来水10 min→1∶400氨水15 s→自来水5 min→伊红30 s→梯度酒精脱水→二甲苯透明→中性树脂封片。

1.5 免疫组化SABC法染色（SABC⁃POD试剂盒，SA1022，Boster）。按以下顺序操作：切片脱蜡水化→3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水洗→0.01 mol/L枸橼酸盐（pH 6.0），热修复抗原→5%BSA室温封闭20 min→37℃孵育一抗1.5 h→二抗，室温20 min，PBS浸洗→SABC，室温 20 min，PBS洗5 min×4次→DAB室温显色10 min→苏木素复染→脱水，透明，封片。

1.6 RT⁃qPCR采用RNAsimple Total RNA Kit［天根生化科技（北京）有限公司］提取实验材料中的RNA，紫外线分析仪分别测定在260 nm和280 nm处的紫外光吸收值（OD值），以OD260/280来计算总RNA的纯度。本组实验的所有标本OD260/280值在1.72～1.94之间，具有实验意义。由重庆生工科技有限公司设计并合成PCR引物（表1），以β⁃actin为内参基因。按PrimeScriptTMRT Master Mix说明书制备10 μL逆转录反应液以及20 μL扩增反应体系，进行逆转录反应后，设置扩增反应条件：预变性 95℃30 s，1循环；PCR反应 95℃ 5S，58 ℃ 34 s，40个循环；绘制融解曲线 95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，1个循环。E⁃cad与CaM的融解曲线均为单一吸收峰，引物特异性较高。由StepOne Plus Real⁃time PCR System输出CT值，按2-△△CT法计算相对表达量。

1.7 统计学方法所有数据采用SPSS 22.0进行分析，RT⁃qPCR各样本的CT值以均数±标准差表示。E⁃cad和CaM的表达情况采用方差分析进行组间两两比较。E⁃cad与CaM的关联性采用直线相关分析。免疫组化数据以均数±标准差表示，2组间不同时间点的比较，采用重复测量数据的方差分析。P＜0.05差异有统计学意义。

表1 PCR引物序列Tab.1 The PCR primer sequences

2 结果

2.1 动物行为学观察全部实验动物术后均出现不同程度的右侧口角下垂、眼裂增大、耳下垂、胡须倒伏、眼睑闭合不全等周围性面瘫表现。至术后14 d，手术组和电针组差别不明显。术后21 d，2组均有一定程度好转，但均未完全恢复，电针组较手术组轻。术后28 d，除手术组仍有1只动物双侧口角不对称外，2组动物静息状态均未见面瘫表现，但进食时手术组患侧口角运动受限。

2.2 HE染色通过HE染色，在光镜下确定面神经元的位置并观察其形态变化。面神经元位于脑桥组织的中下部分靠近腹正中线偏外侧，低倍镜下表现为大多角形运动神经元细胞成团聚集。

2.3 RT⁃qPCR结果

2.3.1 E⁃cad和CaM mRNA相对表达量的分析术后7 d，手术组E⁃cad mRNA表达出现高峰，至14 d后逐渐降低；而电针组术后7 d出现高表达量，维持1周并缓慢上升，至14 d出现表达高峰。2组CaM mRNA的表达均先平稳上升、于14 d至表达高峰后再平稳下降，且电针组的表达量及上升趋势明显高于手术组。将3组E⁃cad和CaM mRNA在各时间点的相对表达量进行组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明电针可促进面神经元中E⁃cad 和CaM mRNA的表达，见图1、2。

2.3.2 E⁃cad和CaM mRNA表达的相关性分析电针组和手术组的相关系数分别为r=0.619和r=0.420，均P＜0.05，说明2组计量资料存在关联性，E⁃cad和CaM mRNA在面神经元的相对表达量正相关。

2.4 免疫组化结果E⁃cad及CaM阳性表达位于面神经元细胞核、细胞浆、轴突、树突，呈棕黄色，见图3。除术后14 d，2组E⁃Cad细胞数目差异有统计学意义（P＜0.001），与手术组相比，电针组E⁃Cad的细胞数目在术后显著增多并于术后21 d至表达高峰，见图4。2组CaM阳性细胞数差异有统计学意义（P＜0.05）。术后电针组CaM阳性细胞数均明显多于手术组，且在术后14 d到达表达高峰（P＜0.001），见图5。

图1 各时间点E⁃cad mRNA相对表达量Fig.1 Relative expression of E⁃cad mRNA in three groups at each time point

图2 各时间点CaM mRNA相对表达量Fig.2 Relative expression of CaM mRNA in three groups at each time point

3 讨论

面神经再生是当今的一大难题，药物、手术等治疗方式存在着一定的局限性，针刺治疗为WHO推荐的治疗周围性面瘫的首选方法［8］。电针疗法选取神经主干或分支通过（或接近）的穴位，将针刺与微量低频脉冲式电流刺激相结合，具有治疗目标明确的特点［9-11］。俞建辉［12］、张中一等［13］将电针疗法应用于周围性面瘫的临床治疗，认为电针的治疗效果显著优于药物治疗和传统针灸疗法。在本实验中，电针组兔右侧口角下垂、耳下垂、胡须倒伏、眼睑闭合不全等面瘫症状较手术组恢复提前且完全，明确了电针治疗周围性面瘫的有效性，与既往研究一致［14］。

面神经再生最重要的因素是保持面神经元的活性，由胞体供给营养，促进轴突的生长［15］。神经再生的微环境中，神经营养因子、黏附分子等信号分子在面神经元的恢复中起着重要的作用；另外，Ca2+、Na+等短时间内通过离子通道大量转运，与神经损伤后的再生修复密切相关［16］。

图3 面神经元CaM、E⁃cad免疫染色（×200）Fig.3 Facial motoneurons in CaM，E⁃cad immunostaining（× 200）

图4 E⁃cad免疫染色阳性细胞数分析Fig.4 Analysis of E⁃cad positive cell numbers by immunohistology

黏附分子主要位于神经元胞膜和细胞外基质中，以受体⁃配体结合的形式，介导细胞与胞外基质之间、细胞与细胞之间相互识别、黏附和信号转导［17］。E⁃cad属于Ⅰ型经典钙依赖性跨膜糖蛋白，通过与Ca2+特异性结合介导同型细胞连接黏附［18］。Calmodulin是细胞内高度保守、广泛存在的一类重要的单链钙离子受体蛋白，细胞内Ca2+浓度升高，可诱导细胞分裂、促进遗传物质合成、调节第二信使CaMP的合成和分解［19-20］。

图5 CaM免疫染色阳性细胞数分析Fig.5 Analysis of CaM positive cell numbers by immunohistology

本实验通过建立右侧面神经上颊支压榨性损伤的动物模型，以穴位电针为干预，发现电针能上调E⁃cad和CaM mRNA在面神经元中表达，并延长了表达高峰期，且电针组E⁃cad和CaM免疫阳性细胞数也高于手术组，说明穴位电针可促进中枢面神经元E⁃cad和CaM的合成和分泌，并能维持其高表达，从而促进面神经元功能的恢复。从E⁃cad与CaM表达的关联性来看，上述两种分子均依赖Ca2+的“激活”，E⁃cad的功能从与第二信使Ca2+结合发生分子构象改变开始［21］，而CaM与Ca2+结合，调控细胞电压依赖性Ca2+通道等离子转运系统的易化和失活，介导细胞信号传导［22-23］。可能是，周围面神经外周损伤致逆向中枢面神经元变性，Ca2+的内流启动修复过程，并与E⁃cad结合使之发挥其生物学功能。同时，Ca2+的内流可诱导CaM的表达量增高，进而对离子通道进行调控。三者之间相互作用，共同促进面神经运动神经元的功能恢复。但电针治疗对胞内Ca2+的浓度变化以及介导的三者之间的具体调控机制，尚需要进一步的研究探索。