何新 胡晓梅 黄文峰 李元成 范琳 张自翔 孟凡

1赣南医学院第一附属医院（江西赣州341000）；2赣南医学院（江西赣州 341000）

结直肠癌是危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一，大约20%的新诊断的结直肠癌已经并发转移性，严重的影响了患者的治疗及预后［1-2］。因此，寻找新的诊疗靶点及策略显得尤为重要［2］。研究［3］表明，结直肠癌的发生、发展与信号通路失调有关，其中Ras信号传导是最常发生失调的一种。因此，靶向Ras信号有望成为治疗结直肠癌的治疗手段［3］。Ras是一系列膜结合的小GTP酶，包括NRAS，HRAS和KRAS［4］。Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子（RasGEFs）和GTP酶活化蛋白（GAPs）负责在活性GTP结合Ras（Ras⁃GTP）和非活动GDP结合Ras（Ras⁃GDP）之间转换［5］。 Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子 1（RasGRF1）是促进 Ras⁃GTP 活化的RasGEF家族成员［6］。最近有研究［7］证实在星形细胞瘤中RasGRF1高表达，RasGRF1的沉默导致癌细胞中miR⁃137表达上调，显着抑制细胞增殖，迁移和侵袭并增强体外细胞凋亡。然而，目前Ras⁃GRF1在人结肠癌细胞中的表达模式和作用大部分仍然未知，国内尚未见相关文献报道。KRAS基因突变及RAS信号通路活化是结直肠癌靶向治疗耐药的主要机制，所以针对RAS基因突变及导致RAS信号通路的异常活化的问题，是当今结直肠癌靶向治疗中的难题［8］。本研究选择RasGRF1作为潜在的治疗靶标，探讨RasGRF1对人结肠癌细胞HCT116的增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果将为结肠癌的靶向治疗挖掘到有价值的研究靶分子，也为其它RAS突变相关的肿瘤研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料人结直肠癌细胞株HCT116、SW116和SW480细胞（购于ATCC）；Varioskan Flash连续光谱多功能酶标仪（美国Thermo公司）；T1⁃96型PCR仪（德国BIOMETRA公司）；FACS calibur流式细胞仪（美国BD公司）。RPMI1640培养基、0.25%胰酶（美国HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；lipofectamine 2000（美国Thermo Fisher Scientific公司）；siRasGRF1及Control siRNA（美国Sigma公司）；MTT、DMSO（Sigma公司）；Annexin V⁃FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基公司）。

1.2 细胞培养及转染HCT116、SW116和SW480细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，每3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 siRNA表达载体的制备及转染使用在线工具 http：//i.cs.hku.hk/～sirna 设计 RasGRF1 的 siRNA序列（siRasGRF1；有义：5′⁃CUAAAGCUUUGAUUG⁃AUAAdTdT⁃3′；反义：5′⁃UUAUCAAUCAAAGCU⁃UU⁃AGdTdT⁃3′）。为了优化RasGRF1敲低的效率，使用lipofectamine 2000将不同浓度的siRNA（25，50，100和200 nmol/L）转染到HCT116细胞中。未转染和空载体转染的细胞分别用作空白和阴性对照（NC）。

1.4 逆转录聚合酶链式反应（RT⁃PCR）检测结直肠癌细胞系HCT116，SW116和SW480中RasGRF1的mRNA表达。分别收集HCT116，SW116和SW480的细胞，提取总RNA（按试剂盒说明操作），电泳鉴定总RNA提取效果，定量后进行RT⁃PCR。RasGRF1引物序列：正义引物为5′⁃CGCTGCCTCC⁃ACAACTACAA⁃3′，反义引物为 5′⁃ACACAGGGTG⁃GGTCACAATTT ⁃3′。β⁃actin序列：正义引物为5′⁃CATGGGTCAGAAGGATTCCT⁃3′，反义引物为 5′⁃TCGTCCCAGTTGGTGACGAT⁃3′。共同 PCR 条件为：94℃变性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。PCR产物经3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。实验重复3次。

1.5 四氮噻唑蓝（MTT）比色法分析细胞增殖采用MTT法测定分别干扰RasGRF1前后24、48、72 h的各组细胞存活率。取3块96孔板，以4×104/mL的密度接种HCT116细胞悬液180 μL/孔，实验设siRNA组、阴性对照组（NC组）、及空白对照组（HCT116组），每组设4个复孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养。转染24、48、72 h后，取出相应96孔板，每孔分别加入5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h。吸弃各孔液体，每孔加入DMSO 150 μL，置于摇床上震荡10 min，用酶联免疫吸附法测定490 nm处吸光度（A）值。

1.6 流式细胞术检测凋亡和细胞周期改变取6块6孔板，分两组，分别进行凋亡和细胞周期检测。以4×104/mL的密度接种HCT116细胞悬液180 μL/孔，实验设siRNA组、阴性对照组（NC组）、及空白对照组（HCT116组）。转染24 h后，胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2遍，1 000 r/min离心5 min，弃上清，缓慢加入预冷的70%乙醇，4℃过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤2遍，加入RNA酶，37℃水浴 30 min ，一组加入5 μL Annexin V⁃FITC混匀后，再加入5 μL PI混匀后4℃避光染色30 min，流式术分析各组的早期凋亡和晚期凋亡情况。另一组仅加入5 μL PI混匀后4℃避光染色30 min，流式术分析细胞周期的变化。

1.7 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RasGRF1在人结肠癌细胞HCT116中过表达本研究检测了3株结直肠癌细胞系（HCT116，SW116和SW480）中RasGRF1的mRNA表达。在这3株细胞系中，HCT116细胞的RasGRF1的mRNA水平，与其他两种细胞相比明显升高（P＜0.05，图1）。因此，选择HCT116进行以下实验。

图1 结直肠癌细胞系HCT116，SW116和SW480中RasGRF1的表达Fig.1 Expression of RasGRF1 in colorectal cancer cell line HCT116，SW116 and SW480

2.2 RasGRF1对人结肠癌细胞HCT116增殖的影响本研究还检查了HCT116中siRNA介导的RasGRF1敲低的效率。如图2所示，在HCT116中，针对RasGRF1的siRNA的抑制率可达85.71%，表明RasGRF1在HCT116中的有效抑制。RasGRF1在HCT116细胞增殖中的作用见图3、表1。将RasGRF1siRNA及NCsiRNA分别导入HCT116细胞，发现与NC组及正常细胞组相比，发现siRas⁃GRF1转染的HCT116细胞的增殖率显着降低（P＜0.01）。

图2 qRT⁃PCR检测各种浓度的NC siRNA和siRasGRF1转染HCT116的RasGRF1的表达Fig.2 qRT⁃PCR detection of various concentrationsof NC siRNA and siRasGRF1 transfection of HCT116 for RasGRF1 expression

2.3 RasGRF1对人结肠癌细胞HCT116凋亡和细胞周期的影响为了研究siRNA干扰RasGRF1表达对HCT116增殖的抑制作用是否与细胞凋亡、细胞周期相关，本研究行流式细胞术测定了Ras⁃GRF1对早期凋亡和晚期凋亡的影响及细胞周期的分布。与对照组相比，siRasGRF1转染组的早期和晚期凋亡率显着增加（P＜0.05，图4），表明由于siRNA干扰RasGRF1表达引起的细胞增殖率的显著降低可能与其细胞早期和晚期凋亡率显着增加有关。本研究还使用流式细胞术测定了siRNA干扰RasGRF1表达引起的细胞周期的分布变化。与对照组相比，siRNA干扰RasGRF1表达导致G1期（凋亡群体）细胞增加13%以上，S期细胞也明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05，见图5）。这表明siRNA干扰RasGRF1表达引起的的细胞增殖降低可能也于细胞周期停滞在G1期相关。

图3 MTT法检测RasGRF1siRNA干扰对HCT116细胞增殖的影响（#P＜0.01）Fig.3 Effect of RasGRF1siRNA transduction on proliferation of HCT116 cells by MTT assay（#P ＜ 0.01）

表1 RasGRF1siRNA干扰对HCT116细胞增殖的影响Tab.1 Effect of RasGRF1siRNA transduction on proliferation of HCT116 cell ±s

表1 RasGRF1siRNA干扰对HCT116细胞增殖的影响Tab.1 Effect of RasGRF1siRNA transduction on proliferation of HCT116 cell ±s

注：*P＜0.01

生长增殖率HCT116 NCsiRNA siRasGRF1 72 h 327.23±1.1*32523±6.2*273.73±4.9 0 h 100 100 100 24 h 125.01±49 129.31±3.4 120.07±71 48 h 206.23±1.1*199.52±7.2 188.15±5.6

图4 siRNA干扰RasGRF1表达对HCT116细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of siRNA interference with RasGRF1 expression on apoptosis of HCT116 cells

图5 siRNA干扰RasGRF1表达对HCT116细胞周期分布的影响Fig.5 Effect of siRNA interference with RasGRF1 expression on cell cycle distribution of HCT116

3 讨论

随着近年来人们生活模式及饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率每年仍呈上升趋势。研究认为，结直肠癌的发生、发展与某些基因的异常表达调控及信号通路的异常密切相关［8］。既往研究表明：作为RasGEF超家族成员，RasGRF1在包括人横纹肌肉瘤，皮肤癌和膀胱癌在内的一些人类癌症中表达上调，RasGRF1的过表达不仅促进癌细胞增殖和侵袭，而且保护癌细胞抵抗凋亡［9-10］。研究［9］发现，通过下调胰岛素样生长因子2的表达，发现RasGRF1表达的降低可抑制平滑肌肉瘤细胞的迁移。另有研究［10］表明，RasGRF1衍生的多肽可竞争性抑制RasGRF1，导致Ras⁃GTP的细胞水平降低，并抑制人膀胱癌的细胞增殖和迁移。最近，有研究［11］报道了在结直肠患者的肿瘤和血浆样本中测量的KRAS突变的一致性，切除后检测血浆中的体细胞突变与CRC中的疾病复发密切相关。类似地，在非小细胞肺癌中，血浆中KRAS突变的检测与对治疗的反应缺乏相关［12］。因此，靶向RasGRF1可能成为恶性肿瘤治疗的潜在手段。

在本研究中，笔者发现RasGRF1在结肠癌细胞HCT116中过度表达，这提示RasGRF1可能在结直肠癌的发生、发展中起重要作用。因此，HCT116细胞系是用于研究结直肠癌中RasGRF1功能的良好细胞模型。正如预期的那样，本研究结果显示siRNA干扰RasGRF1表达抑制HCT116的细胞增殖。本研究使用流式术测定了siRNA干扰RasGRF1表达引起的早期凋亡、晚期凋亡和细胞周期的分布变化，发现siRasGRF1转染组的HCT116的早期和晚期凋亡率显着增加，并导致细胞周期停滞在G1期。本研究的不足之处为尚缺乏临床标本数据支持，有待临床收集结肠癌及癌旁标本及进行前瞻性研究进一步验证所得结论。先前的研究［13］表明，结直肠癌的发生、发展与Ras信号通路密切相关。下一步实验，计划继续研究siRNA干扰RasGRF1表达对Ras通路下游分子（包括p⁃AKT，p⁃PI3K和p⁃ERK）活化的影响，进一步探讨siRNA干扰RasGRF1表达可能是通过哪些信号通路诱导结肠癌细胞HCT116的增殖和凋亡。

本研究首次研究报告了RasGRF1表达对结肠癌细胞HCT116的增殖和凋亡的影响，结果表明：RasGRF1在结肠癌细胞HCT116的增殖和凋亡过程中起到了重要作用，RasGRF1可能作为一种促癌因子参与结肠癌的发生、发展过程。虽然多种肿瘤中均证实了RasGRF1对肿瘤增殖和转移的影响，本研究也在结肠癌中针对肿瘤增殖和凋亡开展了一系列相关研究并取得了一定的阳性结果，但目前RasGRF1作为结肠癌治疗的靶点仍未被发现，也缺乏体内实验的进一步验证。后续工作中，笔者将综合临床标本及体内动物实验模型，筛选RasGRF1相关的作用靶点，明确RasGRF1在结肠癌发生、发展中的确切分子机制，为其将来的临床应用提供可靠依据。综上所述，本研究探索了RasGRF1对结肠癌细胞增值、凋亡及细胞周期的影响，进一步研究有望作为结肠癌患者独立的分子标志物和新的治疗靶点。