马婷婷 党嫣# 贾培丽 鲜建桥 刘双月 许涛 王爱梅

钙蛋白酶2(Calpain 2)是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，当钙离子(Ca2+)增多时可被激活，进而触发其下游转录因子的促凋亡活动，导致细胞凋亡[1]。研究表明，Calpain 2可在小鼠耳蜗中表达，并且随着顺铂给药浓度的逐渐增大，小鼠耳蜗内Calpain 2的表达亦逐渐增强，进而诱导耳蜗毛细胞凋亡，造成小鼠听力损失[2～4]。葛根素是从野葛根中提取出的一种黄酮苷类物质，具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用[5]，临床已用于治疗冠心病、高血压、突发性聋等多种疾病[6]。最新文献报道，葛根素可有效抑制卡那霉素的耳毒性，改善小鼠的听功能[7]。然而，葛根素是否也能有效防护顺铂的耳毒性及其防护作用是否与Calpain 2有关，目前尚不清楚。因此，本研究拟通过观察葛根素对顺铂致毒小鼠耳蜗Calpain 2表达的影响，探讨葛根素对顺铂耳毒性的防护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 健康雄性BALB/c小鼠60只，体重18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；顺铂购自美国Sigma公司；葛根素购自成都天台山制药有限公司；兔抗Calpain 2多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；FITC标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自美国EarthOx公司；Smart EP&OAE 听觉诱发电位-耳声发射记录系统由美国IHS公司生产。

1.2实验方法

1.2.1实验动物及分组 60只小鼠随机分成4组，每组15只(30耳)，其中，顺铂组腹腔注射顺铂4.5 mg·kg-1·d-1，连续5天；葛根素组腹腔注射葛根素 200 mg·kg-1·d-1，连续14天；顺铂+葛根素组先提前腹腔注射葛根素 200 mg·kg-1·d-19天，在第10天同时腹腔注射顺铂 4.5 mg·kg-1·d-1，连续5天；对照组腹腔注射等量生理盐水，连续14天。用药期间每天监测小鼠体重以调整药量。

1.2.2听性脑干反应(ABR)测试 各组小鼠在给药前后均进行ABR测试。用1%戊巴比妥钠90 mg/kg对小鼠进行腹腔麻醉；给予小鼠短纯音(tone burst)刺激，8、12和24 kHz 3个频率，记录ABR阈值。带通滤波100～3 000 Hz，叠加1 024次，扫描时程16.0 ms。声刺激强度从95 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，以刚引出ABR波Ⅰ并至少重复2次的最小刺激声强度为反应阈；同一刺激频率下给药前后的反应阈差值记为ABR阈移[8]。

1.2.3耳蜗标本处理 动物停药并测试完ABR后立即断头，速取听泡。体视显微镜下暴露耳蜗，并从蜗顶缓慢灌入含4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，然后将标本放入相同溶液中4 ℃下固定24 h。PBS清洗后放入10% EDTA中4℃下脱钙3～5天备用。

1.2.4耳蜗基底膜毛细胞计数 取脱钙后耳蜗，在体视显微镜下分离基底膜并平铺于载玻片上，滴加罗丹明-鬼笔环肽(1∶200稀释)溶液，室温避光染色1 h，然后封片。荧光显微镜下选取0.17 mm标尺为一个视野，从基底膜顶端向底端连续观察毛细胞，并将毛细胞计数结果输入计算机，应用耳蜗毛细胞定量软件(KHRI Cytocochleograms，Version 3.0)进行分析。

1.2.5Calpain 2免疫荧光染色 取脱钙后耳蜗，经PBS冲洗后进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋，然后沿蜗轴正中行5 μm连续切片。切片在60 ℃下烘烤1 h后脱蜡至水，PBS清洗后抗原修复10 min；封闭液室温孵育1 h后，滴加抗Calpain 2抗体(1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜；取出切片用PBS清洗后，滴加荧光二抗(1∶200稀释)，37 ℃孵育1 h；PBS清洗后封片，荧光显微镜下观察结果并拍照，阴性染色切片用PBS代替一抗，其他过程不变。

每组随机取10张免疫荧光图片，应用Image-Pro Plus 6.0软件在同等条件下测量各组耳蜗外毛细胞、螺旋神经节和血管纹等部位Calpain 2阳性产物的光密度值，光密度值越大，表示阳性反应越强烈[9]。

1.2.6Calpain 2蛋白质印迹检测 小鼠断头后速取耳蜗组织，4个耳蜗为一份样本，加入RIPA 裂解液，于冰下超声粉碎，然后4 ℃下离心25 min (12 000 rpm/min)，取上清测定蛋白含量。蛋白样本SDS聚丙烯凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Calpain 2抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜。TBST清洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000稀释)室温孵育1.5 h，TBST清洗后，ECL法发光显影。全自动凝胶成像系统对条带进行半定量分析，以GAPDH作为内参照物，Calpain 2/GAPDH比值代表Calpain 2的蛋白表达水平。

2 结果

2.1ABR阈移 由表1可见，与对照组相比较，顺铂组小鼠各频率ABR阈移均显著增大(P<0.01)；顺铂+葛根素组各频率ABR阈移虽较对照组增大(P<0.01)，但比顺铂组明显减小(P<0.01)；葛根素组与对照组小鼠ABR阈移无明显差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组小鼠各频率的ABR阈移(n=30耳)

注：▲与对照组比较，P<0.01；△与顺铂组比较，P<0.01

2.2耳蜗外毛细胞计数结果 由表2可见，与对照组相比较，顺铂组小鼠耳蜗基底膜各回外毛细胞缺失率均明显增大(P<0.01)；与顺铂组相比，顺铂+葛根素组底回和中回外毛细胞缺失明显减少 (P<0.01)；葛根素组与对照组相比较，各回外毛细胞缺失率差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 各组小鼠耳蜗基底膜各回外毛细胞缺失率

注：▲与对照组比较，P<0.01；△与顺铂组比较，P<0.01

2.3Calpain 2 免疫荧光染色结果 Calpain 2在四组小鼠耳蜗的外毛细胞、螺旋神经节及血管纹三个部位均有表达(绿色荧光)(图1)。显微图像分析结果显示，顺铂组小鼠耳蜗上述部位Calpain 2 表达较对照组明显增强(P<0.01)；顺铂+葛根素组小鼠耳蜗Calpain 2表达较顺铂组明显减弱(P<0.01),葛根素组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

图1 各组小鼠耳蜗Calpain 2的表达(免疫荧光染色,标尺=20 μm)

表3 各组小鼠耳蜗Calpain 2表达的平均光密度值(n=4)及Calpain2/GAPDH比值

注：与对照组相比，▲P<0.01，*P<0.05；与顺铂组相比，△P<0.01；#P<0.05

2.4Calpain 2蛋白质印迹检测结果 对照组和葛根素组小鼠耳蜗Calpain 2的电泳条带较弱，而顺铂组小鼠耳蜗Calpain 2的电泳条带明显比对照组深；顺铂+葛根素组小鼠耳蜗Calpain 2的电泳条带则较顺铂组明显减弱(图2)。半定量分析结果显示，顺铂组Calpain 2/GAPDH比值明显大于对照组(P<0.01)；顺铂+葛根素组Calpain 2/GAPDH比值明显小于顺铂组(P<0.05)，葛根素组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

图2 各组小鼠耳蜗Calpain 2电泳条带

3 讨论

Calpain是一类依赖Ca2+激活的中性半胱氨酸蛋白酶，主要包括两种同分异构体，即Calpain 1和Calpain 2。Calpain 1只需微摩尔浓度的Ca2+就可被激活，故又称μ-Calpain；而Calpain 2则需毫摩尔浓度的Ca2+才能被激活，故又称m-Calpain。目前大量研究表明，Calpain参与了物理或化学因素引起的听力损伤，Yamaguchi等[10,11]证明Calpain介导的噪声性聋机制与氧化应激引起的细胞间通讯蛋白CX34表达下降有关;另外，Calpain可激活下游凋亡通路相关因子，诱导耳蜗螺旋神经节细胞凋亡，介导高糖所引起的大鼠听觉损伤[12]；另有研究证明，在卡那霉素致聋小鼠耳蜗血管纹上Calpain高表达，与对照组相比差异显著[13]；还有研究发现，Calpain在下丘神经元的表达水平与水杨酸引起的SD大鼠听力损伤程度成正比[14]；本实验室前期研究结果表明，Calpain 2介导了顺铂的耳毒性[2～4]；张立伟等[2]观察到不同浓度顺铂可诱导离体小鼠耳蜗Calpain 2的高表达，使毛细胞凋亡明显增多；Chang等[3]给成年小鼠连续5天腹腔注射不同浓度顺铂后，小鼠ABR阈移明显增大，同时耳蜗毛细胞内Calpain 2的表达较对照组明显增强，并且随着顺铂给药浓度的逐渐加大，Calpain 2的表达也逐渐增强。本研究发现顺铂组小鼠耳蜗外毛细胞、螺旋神经节及血管纹中Calpain 2的表达均较对照组明显增强，同时ABR阈移和外毛细胞缺失率较对照组明显增大，进一步证明Calpain 2介导了顺铂的耳毒性，与上述研究结果一致。

葛根素是中药葛根的主要活性成分，具有抗氧化作用，可通过减少ROS的过量生成以减轻氧化应激对神经细胞和成骨细胞的损伤[15,16]。都君君等[17]研究表明，葛根素可显著减少妊娠期糖尿病大鼠脑组织内丙二醛含量，增强超氧化物歧化酶含量，减轻氧化应激对脑组织的损伤；此外，葛根素还具有抗凋亡作用，可通过抑制Calpain蛋白的高表达，以减少高糖诱导的血管内皮细胞凋亡[18]。 近年来的研究发现，葛根素对突发性聋、老年性聋和药物性聋均具有明显疗效。葛根素可明显降低突发性聋患者体内过氧化脂质水平，同时增强超氧化物歧化酶的水平，减轻氧化应激引起的听功能损伤[19]。最近有临床报道称，利用葛根素与神经节苷脂钠联合治疗突发性聋后，患者听功能明显改善[20]；葛根素联合声频共振对早期老年性聋具有良好的治疗效果，并能延缓老年性聋的发生，减轻耳鸣的症状[21]；同时，葛根素还能有效抑制卡那霉素的耳毒性，改善小鼠的听功能，这可能与葛根素抑制核转录因子NF-κB p50和NF-κB p65的活化易位，减少毛细胞凋亡有关[7,8]。本研究结果显示，顺铂+葛根素组小鼠耳蜗Calpain 2表达较顺铂组明显减弱，同时ABR阈移和外毛细胞缺失率较顺铂组亦明显减小，表明葛根素亦可有效防护顺铂对小鼠的耳毒性损伤，这可能与其下调顺铂诱导的Calpain 2高表达有关。此外，本研究发现葛根素本身对小鼠听功能无损害效应，提示葛根素具有广阔的应用前景；至于葛根素发挥防护作用的具体机制，尚有待今后进一步研究。